[0039] 收集出峰時(shí)間為300~320min的部位，減壓除去溶劑后，所剩固形物即為化合物 2(40mg)；
[0040] 收集出峰時(shí)間為360~390min的部位，減壓除去溶劑后，所剩固形物即為化合物 3(16mg)；
[0041] 收集出峰時(shí)間為420~450min的部位，減壓除去溶劑后，所剩固形物即為化合物 4(llmg) 〇
[0042] 本發(fā)明出峰時(shí)間從栗入上相的時(shí)間算起。本發(fā)明對各成分的分離速度較快，整個(gè) 分離過程，從栗入溶劑上相到峰分離結(jié)束所花時(shí)間僅為480min。
[0043] 結(jié)構(gòu)鑒定
[0044] 化合物1:黃色粉末，ESI-MS(負(fù)離子模式）：m/z625. 16?；衔飏H-NMR和 13C_NMR數(shù)據(jù)見表2和表3?；衔?的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]中quercetin-3-〇-0-D-glucopy rannosy-(1 - 6) - 0 -D-glucopyranoside的數(shù)據(jù)基本一致。
[0045] 化合物2 :黃色粉末，ESI-MS(負(fù)離子模式）：m/z667. 22,MS/MS產(chǎn)生的二級碎片 離子有m/z625. 13、607. 13、301. 01?；衔?4-匪1?和13C-NMR數(shù)據(jù)見表2和表3。化合 物 2 的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]中quercetin3-〇_[2"' -0_acetyl-0 -D-glucopyranosyl_(l- 6) -0 -D-glucopyranoside]的數(shù)據(jù)基本一致。
[0046] 化合物4:黃色粉末，ESI-MS(負(fù)離子模式）：m/z667. 23?；衔?的分子量與化 合物2的分子量一致。MS/MS產(chǎn)生的二級碎片離子有m/z625. 13、607. 13、301.01，與化合物 2 -致，丟失了碎片CH3C00、C2H503、C14H23012，并且二者1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)相似，可見二者 為同分異構(gòu)體，苷元為槲皮素。不同之處為乙酰基與槲皮素苷的聯(lián)接位置。在HMBC圖譜中， 乙?；? =0(8^169.7)與5"4.66相關(guān)，5"4.66與(：-2"'（8^71.2)和(：-4"'（8#7.6) 相關(guān)，HSQC圖譜中，SH4.66與C-3"'77.8)相關(guān)，因此，可確定乙?；cC-3"'相連， 化合物4為quercetin3-〇_[3"，-0_acetyl-0 -D-glucopyranosyl_(l一6)-0-D-glucopyr anoside]〇
[0047] 化合物3 :黃色粉末，ESI-MS(負(fù)離子模式）：m/z667. 24。MS/MS產(chǎn)生的二級碎 片離子有m/z625. 16、607. 16、301.01，與化合物2和化合物4一致，丟失了碎片0130)0、 C2H503、C14H23012，并且核磁數(shù)據(jù)也與化合物2和化合物4相似。不同之處為乙?；c槲皮素 苷的聯(lián)接位置。在HMBC圖譜中，乙?；蠧= 0(Sc170. 3)與SH3. 93和4. 10相關(guān)，說明 乙?；赡芘c一個(gè)亞甲基相連。在HSQC圖譜中，SH3. 93和4. 10和63. 5(C-6"'）相 關(guān)，由此可知，乙?；cC-6"'相連，化合物3為quercetin3-〇_[6"'-0-acetyl-0 -D-glu copyranosyl_(l一 6)-0 -D-glucopyranoside]〇
[0048]
[0049]表2
[0050]
[0051] 注：化合物1(溶劑為dmso)和化合物2(溶劑為methanol_d4)由400MHz核磁共振 儀測定；化合物3(溶劑為dmso)和化合物4(溶劑為dmso)由600MHz核磁共振儀測定；化 合物1的化學(xué)位移歸屬參考文獻(xiàn)，其他化合物的化學(xué)位移歸屬根據(jù)DEPT、1!!-1!!COSY、HSQC 和HMBC數(shù)據(jù)。
[0052] 表3化合物1~413CNMR數(shù)據(jù)
[0053]
[0054] 注：化合物1 (溶劑為dmso)和化合物2 (溶劑為methanol_d4)由400MHz核磁共振 儀測定；化合物3 (溶劑為dmso)和化合物4 (溶劑為dmso)由600MHz核磁共振儀測定；化 合物1的化學(xué)位移歸屬參考文獻(xiàn)，其他化合物的化學(xué)位移歸屬根據(jù)DEPT、1!!-1!!COSY、HSQC 和HMBC數(shù)據(jù)。
[0055] 實(shí)施例2 2種已知黃酮類成分的制備
[0056] (1)粗提物制備
[0057] 稱取全緣葉綠絨蒿花10g，打粉機(jī)粉碎，粉末不大于0.3mm(基本全部通過3號 篩），加70%乙醇（v/v) 200mL，超聲（45kHz，300w)提取3次，每次45min，合并3次濾液，減 壓回收乙醇，得濃縮液，將濃縮液置于-80°C冰箱過夜后，冷凍干燥，得干浸膏3.llg，干浸 膏得率為31. 1%。
[0058] 取浸膏約150mg，用50mL水溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，依次用乙酸乙酯和正丁醇萃 取，合并乙酸乙酯和正丁醇萃取液，45°C減壓回收溶劑，所得粗提物備用。
[0059] (2)分離純化
[0060] 在分液漏斗中按乙酸乙酯/正丁醇/水（2:3:5,v/v/v)配置兩相溶劑系統(tǒng)共2L， 充分振搖，靜置分層。以上相為固定相，下相為流動相，將制備好的樣品浸膏溶于20mL下相 中，備用。
[0061] 以20mL/min的流速將溶劑系統(tǒng)上相栗入主機(jī)充滿分離螺旋管，循環(huán)水浴溫度 35°C，UV檢測波長254nm，轉(zhuǎn)速900r/min，正轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)速穩(wěn)定后，以流速2.OmL/min栗入下相， 待下相從管柱出口流出并且基線穩(wěn)定后，將樣品溶液由進(jìn)樣圈注入，根據(jù)色譜圖手動收集 各色譜峰組分（見圖1)，即可分別得到化合物1~4。
[0062] 其中，收集出峰時(shí)間為250~280min的部位，減壓除去溶劑后，所剩固形物即為化 合物1 ;
[0063] 收集出峰時(shí)間為300~320min的部位，減壓除去溶劑后，所剩固形物即為化合物 2〇
[0064] 本發(fā)明出峰時(shí)間從栗入上相的時(shí)間算起。
[0065]
[0066] 實(shí)施例3本發(fā)明化合物抗氧化活性研究
[0067] 1 材料
[0068] 普析TU-1950紫外分光光度計(jì)（北京普析公司）；METTLERAE240型電子天平（梅 特勒一托利多（上海）有限公司），KQ-250B超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。
[0069]DPPH(悌希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；抗壞血酸（廣東光華科技股 份有限公司）；BHT(成都科龍化工試劑廠），其他試劑為分析純，水為蒸餾水。實(shí)驗(yàn)樣品： 化合物lquercetin-3_〇-0 -D-glucopyrannosy-(l-6)-0 -D-glucopyranoside，化合 物2quercetin3_0_[2'，' _0_acetyl_0 _D_glucopyranosyl_(l一 6)_0 _D_glucopyranosi de，化合物3quercetin3-0_[6"，-0_acetyl-0 -D-glucopyranosyl_(l一6)-0 -D-glucopy ranoside，化合物4quercetin3-0-[3"，-0_acetyl-0 -D-glucopyranosyl_(l一6)-0 _D_g lucopyranoside。以上實(shí)驗(yàn)樣品采用實(shí)施例1方法分離得到。
[0070] 2方法
[0071] DPPH溶液的配制：精密稱取DPPH粉末7. 30mg，加入無水乙醇定容至50mL容量瓶 中，得DPPH儲備液。將儲備液再稀釋5倍，得濃度為0.074mmol/L、吸光度約為0.7的DPPH 工作液。
[0072] 樣品溶液的配制：精密稱取樣品粉末適量，加H20配制成0. 32mmol/L儲備液，測定 時(shí)用H20稀釋成0? 16mmol/L、0. 08mmol/L、0. 04mmol/L、0. 02mmol/L、0. 005mmol/L〇
[0073] 3清除DPPH能力測定
[0074]DPPH自由基清除能力測定方法參考ZhouG等[18]的方法。吸取樣品溶液0.4mL 不同濃度樣品溶液和2. 6mLDPPH工作液于比色管中，避光反應(yīng)lh后，于517nm處測定吸光 度值。以H20代替樣品溶液作為空白，以無水乙醇代替樣品和DPPH溶液作為空白對照，以 相同濃度的Vc和BHT為陽性對照，清除率按下式計(jì)算。
[0075]
[0076] 式中As為空白，即70%乙醇加DPPH溶液的吸光度；不同濃度樣品溶液和DPPH 溶液的吸光度；A。為空白對照的吸光度。
[0077] 4結(jié)果與討論
[0078] 不同物質(zhì)濃度樣品和陽性對照物Vc和BHT對DPPH的清除率見圖2，IC5。值分 別為化合物 1 (〇. 〇57mmol/L)，化合物 2 (0. 051mmol/L)，化合物 3 (0. 049mmol/L)，化合物 4(0. 067mmol/L)，Vc(0. 159mmol/L)，而在該濃度梯度下，BHT的最大DPPH清除率未超過 50 %，故無法計(jì)算IC5J；t。
[0079] 從結(jié)果可以看出，從全緣葉綠絨蒿花中分離得到的化合物1~4清除DPPH自由基 的能力要強(qiáng)于Vc和BHT，有很好的抗氧化活性。
[0080] 參考文獻(xiàn)
[0081] [1]中國科學(xué)院中國植物志編委會.中國植物志.第32卷.2004版[M].北京： 科學(xué)出版社，2004 :7.
[0082] [2]帝瑪爾?丹增彭措