一種arf1基因3′-UTR及其在控制基因表達(dá)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及arfl基因mRNA的3' -UTR在調(diào)控基因表達(dá)中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]植物基因表達(dá)過程分為啟動(dòng)子的啟動(dòng)、轉(zhuǎn)錄起始、延伸及終止。基因的啟動(dòng)需要可誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子，同樣，基因表達(dá)的終止也需要可靠的終止子?；蚬こ淘诤艽蟪潭壬嫌匈囉诨蜣D(zhuǎn)錄的有效啟動(dòng)和終止。真核生物中，轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程在空間和時(shí)間上是分開進(jìn)行的，轉(zhuǎn)錄過程中的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控都是十分重要的。一個(gè)轉(zhuǎn)錄本的總體結(jié)構(gòu)是由5'端非翻譯區(qū)(5' untranslated reg1n，5'_UTR)、編碼區(qū)(open reading frame，ORF)和3 '端非翻譯區(qū)(3 '-UTR)三部分組成。3'端非翻譯區(qū)(3 " untranslated reg1n, 3 " -UTR)是真核生物特有的序列結(jié)構(gòu)之一，3' -UTR通過影響mRNA的積累、穩(wěn)定性和翻譯效率，在調(diào)控基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平中起到重要作用。目前植物基因工程中常用的終止子是Tnos，除此以外其他的終止子很少，尋找可替代Tnos的終止子對(duì)于植物基因工程技術(shù)的應(yīng)用具有重要意義。
[0003]腺苷酸核糖基化作用因子arfl基因是一種編碼小G蛋白，負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育基因。是一種組成型表達(dá)基因。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供arfl基因mRNA的3' -UTR在調(diào)控基因表達(dá)中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
所述arfl基因3^ UTR，基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，其是將編碼arfl的3' -UTR的核苷酸序列與報(bào)告基因gus⑶S序列重組，獲得gus⑶S-arfl 3r -UTR的重組基因，然后整合至宿主基因組中，并隨宿主基因組表達(dá)。具體為:依據(jù)arfl基因mRNA 3’-UTR的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，弓丨物序列 F:5’ TTCGAGCTCTTGAAGCATCTTGGCC 3 ’ R:5’TTGGAATTCGATATGACCAAACGGATT 3’，以“日本晴” DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的條帶，回收純化后，與載體PMD-18T連接測(cè)序。載體pCUb1-CKS' -Tnos用EcoRI和Sac I雙酶切，將arfl基因3’ -UTR片段替換Tnos形成重組質(zhì)粒pCUb1-GUS-arfl3’-UTR，酶切鑒定。將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化過程包括:
1)種子消毒和愈傷誘導(dǎo)；
2)農(nóng)桿菌pUb1-0sSUT2/LBA4404 制備；
3)侵染及共培養(yǎng)；
4)抗性愈傷篩選；
5)抗性愈傷分化、幼苗生根。
[0007]轉(zhuǎn)基因小苗移栽、檢測(cè)、篩選出超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，通過自交重組，獲得轉(zhuǎn)基因純合株系。
[0008]種植Tl代水稻，分別取花期根、莖、葉、花器官以及成熟種子。部分用于組織化學(xué)法檢測(cè)樣品⑶S蛋白(Jeffers0nl987);部分用于提取蛋白測(cè)定總蛋白含量和⑶S酶活性。
[0009]所述宿主為水稻。
[0010]所述編碼arfl的3 ^ -UTR的核苷酸序列如SEQ ID N0.1，以及該序列替換、缺失或添加若干個(gè)核苷酸形成的具有與arfl的3 ^ -UTR同等功能的核苷酸序列。
[0011]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明提供的arfl的3' -UTR片段可替代Tnos，作為基因表達(dá)調(diào)控序列，可應(yīng)用于植物基因工程。特別是水稻的基因工程修飾，利用來源于水稻自身的序列培育轉(zhuǎn)基因水稻，能夠避免使用外源調(diào)控序列帶來的安全性隱患。
【附圖說明】
[0012]圖1 arfl基因V -UTR核苷酸序列連接在⑶S表達(dá)載體pCUb1-GUS-arfl3r -UTR上的表達(dá)框示意圖。
[0013]圖2轉(zhuǎn)基因水稻不同組織器官⑶S組織化學(xué)染色圖。其中A、B、C、D、E分別為根、莖、葉、花和種子。U7為轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-arfl 3' -UTR載體水稻；UT為轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-Tnos水稻，作為陽(yáng)性對(duì)照；CK為非轉(zhuǎn)基因水稻，為陰性對(duì)照。
[0014]圖3轉(zhuǎn)基因水稻⑶S蛋白酶活性檢測(cè)法驗(yàn)證arfl 3r -UTR在轉(zhuǎn)基因水稻上的功能。其中GUS-arfl 3 ' -UTR為轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-arfl 3 ' -UTR載體水稻；CK為轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-Tnos水稻作為陽(yáng)性對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步闡述。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不限于本發(fā)明的范圍。
[0016]實(shí)施例1 arfl基因mRNA的3’ UTR的克隆及序列分析
以“日本晴”水稻為材料，采用改進(jìn)的CTAB法(Sambrook et al，1989)提取基因組DNA的提取。以“日本晴”水稻DNA為模板，依據(jù)arfl基因mRNA 3r -UTR對(duì)應(yīng)的DNA序列用Primer5.0 設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列為 F: 5’ TTCGAGCTCTTGAAGCATCTTGGCC 3’、R:5’TTGGAATTCGATATGACCA
AACGGATT 3’。用 Golden DNA Polymerase 擴(kuò)增目的片段，PCR 反應(yīng)體系(50ul)為日本晴，，7jC稻 DNA 2uL，F(xiàn) 和 R 引物各 luL，Golden DNA Polymerase(2.5U/uL)luL, 2xReact1nMix 25uL，最后用滅菌的ddH20補(bǔ)齊至50uL，目的片段大小595bp，電泳檢測(cè)擴(kuò)增條帶，正確后用1%瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒回收3' -UTR片段，與載體PMD-18T連接轉(zhuǎn)化后送生物公司測(cè)序，序列如SEQ ID N0.1所示。序列分析顯示arfl基因mRNA的3 ^ -UTR含有8個(gè)多聚信號(hào)元件和4個(gè)UE。
[0017]實(shí)施例2 pCUb1-^-arfl 3’ -UTR植物表達(dá)載體的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)基因水稻獲得
用限制性內(nèi)切酶 Hind III和 BamH I 將載體骨架 pCXGUS-P (genebank ID: FJ905224)(Chen S.et al., 2009)酶切回收，與Ubiquitin啟動(dòng)子片段連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCUb1-GUS-Tnosο再用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sac I雙酶切重組質(zhì)粒pCUb1-GUS-Tnos，用arfl 3r -UTR片段替換pCUb1-GUS-Tnos中的Tnos，所構(gòu)建的質(zhì)粒命名為pCUb1-GUS-arfl3r -UTR,將該質(zhì)粒電擊到農(nóng)桿菌LBA4404菌株，鑒定正確后，用于轉(zhuǎn)化水稻，鑒定arfl3' -UTR的功能。所構(gòu)載體的表達(dá)框示意圖見圖1。
[0018]將pCUb1-GUS-arfl 3’ UTR重組質(zhì)粒通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入“日本晴”水稻，所獲轉(zhuǎn)化植株經(jīng)30mg/L潮霉素篩選、PCR檢測(cè)鑒定為轉(zhuǎn)基因植株后，種植于溫室中，TO代水稻自交授粉后，收獲Tl代種子。
[0019]實(shí)施例3 ⑶S組織化學(xué)染色法驗(yàn)證arfl 3’ UTR在轉(zhuǎn)基因水稻上的功能
選Tl代純合株系水稻，于開花期分別取根、莖、葉、花器官，成熟期取種子縱切，保留完整的胚和胚乳。采用組織化學(xué)法檢測(cè)樣品⑶S蛋白(Jefferson，1987)表達(dá)。具體步驟如下:將待測(cè)樣品侵入⑶S反應(yīng)液中，37°C保溫?cái)?shù)小時(shí)，然后用無水乙醇、75%乙醇和50%乙醇對(duì)葉片組織進(jìn)行梯度脫色處理，拍照記錄⑶S組織化學(xué)染色結(jié)果，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-arfl 3r -UTR載體的水稻其⑶S蛋白表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-Tnos的水稻，且在植株的不同部位均有較強(qiáng)表達(dá)。
[0020]實(shí)施例4 ⑶S蛋白酶活性檢測(cè)法驗(yàn)證arfl 3r -UTR在轉(zhuǎn)基因水稻上的功能選Tl代純合株系，于開花期分別取根、莖、葉、花器官，成熟期取種子縱切，保留完整的胚和胚乳，提取總蛋白。每個(gè)克隆取3株作為混合樣。用Bradford法(1976)測(cè)定總蛋白含量。用熒光法測(cè)定GUS酶活性。具體步驟為:取一塊96微孔板預(yù)冷，每孔加入50ul的待測(cè)樣品后，迅速加入50ul預(yù)冷的⑶S essay buffer，密封。于37°C保溫反應(yīng)45分鐘，之后迅速加入 900ul 0.2M 的 Carbonate stop buffer 終止反應(yīng)。用 Thermo Scientific 公司的焚光測(cè)量?jī)x，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為355nm、發(fā)射波長(zhǎng)為460nm的濾光片組，掃描方式為終點(diǎn)測(cè)定，收集記錄熒光強(qiáng)度，空白陰性對(duì)照為不加任何樣品的空白孔。將機(jī)器掃描獲得的數(shù)據(jù)結(jié)合樣品總蛋白測(cè)定數(shù)據(jù)計(jì)算GUS酶活性。GUS酶活力單位定義為單位時(shí)間內(nèi)單位質(zhì)量的GUS酶蛋白催化產(chǎn)生的具有熒光活性的4-MU的摩爾數(shù)，具體為每分鐘每毫克GUS酶蛋白催化所產(chǎn)生的4-MU的皮摩爾數(shù)(即pmol/mg/min)。所有材料的GUS酶活性數(shù)據(jù)換算成標(biāo)準(zhǔn)的酶活力單位，根據(jù)不同的酶活力單位來判斷GUS基因在組織中的表達(dá)水平，結(jié)果見圖3。檢測(cè)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-arfl 3r -UTR載體的水稻其⑶S蛋白酶活性明顯高于轉(zhuǎn)pCUb1-GUS-Tnos的水稻，且在植株的根、莖、葉、花器官以及成熟種子中均有較強(qiáng)表達(dá)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.arfl基因3 ^ UTR，其特征在于:所述基因序列如SEQ ID N0.1所示。2.一種如權(quán)利要求1所述arfl基因UTR在轉(zhuǎn)基因植物中控制基因表達(dá)的應(yīng)用。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所編碼的arfl基因:V-UTR的核苷酸序列整合到宿主基因組中，隨宿主基因組表達(dá)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:其是將編碼arfl基因:V-UTR的核苷酸序列整合在宿主基因組中目的基因的3'端。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:具體步驟為:依據(jù)arfl基因3’-UTR的DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列F:5’ TTCGAGCTCTTGAAGCATCTTGGCC 3 ’，R:5’TTGGAATTCGATATGACCAAACGGATT 3’，以水稻DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的條帶，回收純化后，與載體PMD-18T連接測(cè)序；載體pCUb1-CKS' -Tnos用EcoRI和Sac I雙酶切，用將arfl基因3’ -UTR片段替換Tnos形成重組質(zhì)粒pCUb1-GUS_arf 13’ -UTR，酶切鑒定；將正確的重組質(zhì)粒導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化。6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述宿主為水稻。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，提供了arf1基因3′-UTR及其在控制基因表達(dá)中的應(yīng)用，arf1基因3′UTR序列如SEQ？ID？NO.1所示<b>，</b>是將編碼arf1基因3′-UTR的核苷酸序列與報(bào)告基因GUS重組后，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將其整合到植物細(xì)胞中，隨宿主基因組表達(dá)。帶有3′-UTR的GUS與帶有Tnos的GUS相比，蛋白產(chǎn)物顯著增加。本發(fā)明還提供了arf1基因3′-UTR在轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N15/11, C12N15/82, A01H5/00
【公開號(hào)】CN105132412
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510451191
【發(fā)明人】王 鋒, 蘇軍, 管其龍, 陳松彪, 李剛, 顏靜宛, 林智敏, 胡太蛟
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
【公開日】2015年12月9日
【申請(qǐng)日】2015年7月29日