用于制備shRNA的引物及制備方法、載體及構(gòu)建方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及生物
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，尤其涉及一種用于制備shRNA的引物及制備方法、載體及構(gòu)建方法?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是一種普遍存在于生物體內(nèi)、序列特異性強(qiáng)、轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默機(jī)制。目前，采用RNAi技術(shù)快速實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)基因沉默已經(jīng)成為動(dòng)植物基因功能研究中一種有力的實(shí)驗(yàn)工具。[0003]由于動(dòng)植物體內(nèi)各自的特點(diǎn)及其RNAi作用機(jī)制的差異，當(dāng)今用于動(dòng)植物基因功能研究的RNAi的作用分子也有所不同。目前，應(yīng)用較為普遍的發(fā)揮干擾作用的小RNA分子在動(dòng)物體內(nèi)主要有siRNA(smallinterferingRNA)、shRNA(shorthairpinRNA)以amiRNA(artificialmicroRNA)等。而植物體內(nèi)主要有hpRNA(hairpinRNA)和amiRNA。最早采用RNAi技術(shù)研究生物體內(nèi)基因功能的方法是將體外制備好單鏈siRNA分子直接注入線蟲(chóng)體內(nèi)，雖然后來(lái)在動(dòng)植物的基因功能研究中被沿用，但是這種方法的干擾時(shí)效性相對(duì)較短，為達(dá)到有效干擾而提高siRNA濃度又往往有細(xì)胞毒性。現(xiàn)在的RNAi技術(shù)采用的方法多為構(gòu)建一個(gè)特定的RNAi表達(dá)載體，該載體導(dǎo)入動(dòng)植物細(xì)胞后能由RNA聚合酶II型或III型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)的shRNA、amiRNA以及hpRNA(hairpinRNA)等，進(jìn)而干擾與其靶基因的表達(dá)（PlantCell.2006.May;18(5):1121-33.)。[0004]目前，普遍用于構(gòu)建ShRNA干擾表達(dá)載體的方法主要有以下兩種：（I)寡核苷酸退火法，普遍做法是化學(xué)合成兩條特定的寡核苷酸引物，在離體條件下退火形成兩端帶有黏性末端的雙鏈shRNA片段，然后與經(jīng)過(guò)酶切處理同樣帶有黏性末端的載體連接轉(zhuǎn)化，得到含有shRNA干擾表達(dá)單元的重組質(zhì)粒。（II)PCR擴(kuò)增法：設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增控制shRNA表達(dá)啟動(dòng)子的PCR引物，其中正向引物與啟動(dòng)子特異性匹配，反向引物5'末端額外加上針對(duì)目的基因的干擾靶序列，將PCR產(chǎn)物克隆到相應(yīng)的載體上，得到shRNA干擾表達(dá)載體（PhysiolGenomics.2007Novl4；31(3)：554-62.)〇[0005]以上兩種方法雖然都能構(gòu)建各種RNA干擾表達(dá)載體，但也存在不足之處，主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：[0006]-、引物設(shè)計(jì)過(guò)長(zhǎng)，容易產(chǎn)生突變，克隆效率低。方法（I)中使用的寡核苷酸單鏈通常為60-100nt，合成這種長(zhǎng)度的寡核苷酸單鏈不僅合成費(fèi)用大幅提高，而且堿基合成過(guò)程中的錯(cuò)誤率也會(huì)明顯增加，進(jìn)而增加了重組質(zhì)粒篩選的工作量，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。二、操作繁瑣，不適合高通量構(gòu)建RNA干擾載體。[0007]以上兩類(lèi)制備shRNA序列的方法，對(duì)于構(gòu)建單個(gè)或少數(shù)RNA干擾載體雖然可行，但是對(duì)于大批量構(gòu)建RNA干擾載體來(lái)講，工作量大，操作繁瑣，效率低下。方法（II)需要在PCR引物中加上針對(duì)靶基因的干擾序列，通常需要長(zhǎng)引物（通常大于70nt)或者多輪的PCR擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物也需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的雙酶切、回收等步驟，因外源片段一般都較?。?00bp以內(nèi)），回收純化效率較低，而且載體與非目的片段連接或自連的幾率很高，使后續(xù)的篩選鑒定過(guò)程復(fù)雜化，致使工作量增加。[0008]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進(jìn)和發(fā)展?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0009]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種用于制備shRNA的引物及制備方法、載體及構(gòu)建方法，本發(fā)明所提供的shRNA制備方法可快速、高效、低成本、高通量制備高保真性shRNA，尤其適合于大規(guī)模地構(gòu)建動(dòng)植物RNA干擾（RNAinterference，RNAi)表達(dá)載體，用于動(dòng)植物基因的功能研究，旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中引物設(shè)計(jì)過(guò)長(zhǎng)、克隆效率低、操作繁瑣等問(wèn)題。[0010]一種用于制備ShRNA的引物，其中，包括三條引物P1、P2、P3;引物P1長(zhǎng)度為34nt，從5'端開(kāi)始，依次為突出的粘性末端ACCG，21nt的siRNA正向序列，loop序列，以及與siRNA正向序列3'末端3個(gè)堿基反向互補(bǔ)的堿基；引物P2,5'端4個(gè)堿基由ACCG改變?yōu)锳AAA，其余序列與P1相同；引物P3是siRNA正向序列5'末端18nt序列的反向互補(bǔ)序列；其中，loop序列為CTCGAG或ITCAAGAGA。[0011]一種shRNA的制備方法，其中，采用如上所述的三條引物退火合成雙鏈shRNA，包括以下步驟：[0012]針對(duì)目的基因設(shè)計(jì)和合成引物后，將引物Pl、P2和P3分別稀釋為10iiM的濃度后，以1:1:2的比例混合，再加入占總體積1/10的1MNaCl進(jìn)行退火；[0013]將上述混合充分的試劑置于已停止加熱的沸水中，然后待其自然降至室溫。[0014]-種shRNA的表達(dá)載體，其中，所述表達(dá)載體為慢病毒干擾載體，其中包含shRNA表達(dá)框、綠色熒光蛋白表達(dá)框；所述shRNA表達(dá)框包含shRNA表達(dá)啟動(dòng)子，采用如上所述的shRNA的制備方法制備得到的shRNA，以及致死基因ccdB;所述綠色熒光蛋白表達(dá)框包含EFla啟動(dòng)子和copGFP綠色熒光蛋白表達(dá)基因；[0015]所述shRNA表達(dá)啟動(dòng)子為啟動(dòng)子U6、H1或7SK之一。[0016]一種如上所述的shRNA的表達(dá)載體的制備方法，其中，包括以下步驟：[0017]制備載體骨架；[0018]在載體骨架上插入shRNA表達(dá)啟動(dòng)子；[0019]在載體骨架上插入ccdB序列；[0020]在載體骨架上插入如權(quán)利要求2所述的shRNA的制備方法制備得到的shRNA。[0021]所述的shRNA的表達(dá)載體的制備方法，其中，制備載體骨架的過(guò)程如下：[0022]以pCDFl-MCS2-EFl_copGFP載體為模板，PCR擴(kuò)增得到EFla-copGFP片段，用Mlul和Afel雙酶切PCR產(chǎn)物，然后插入到同樣經(jīng)過(guò)Mlul和Afel雙酶切的慢病毒載體pLVX-Puro上，得到載體骨架pLVX-EFla-copGFP-PGK-Puro;[0023]其中，用于擴(kuò)增EFla-copGFP的寡核苷酸引物為EFla-copGFP-F:5'-CGACGCGTCGAAGGATCTGCGATCGCTCCG-3'；EFla-copGFP-R:5'-AGCGCTTTAGCGAGATCCGGTGGAGCCGG-3'。[0024]所述的shRNA的表達(dá)載體的制備方法，其中，插入shRNA表達(dá)啟動(dòng)子的過(guò)程如下：[0025]用Clal和Xhol雙酶切載體pLVX-EFla-copGFP-PGK-Puro,去磷酸后電泳回收；擴(kuò)增shRNA表達(dá)啟動(dòng)子的PCR產(chǎn)物，用Clal和Xhol雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物；將shRNA表達(dá)啟動(dòng)子連接到pLVX-EFla-copGFP-Puro線性載體的相應(yīng)位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB平板，培養(yǎng)過(guò)夜，鑒定后得到的載體為pLVX-hU6/Hl/7SK-EFla-copGFP-PGK-Puro。[0026]所述的shRNA的表達(dá)載體的制備方法，其中，插入ccdB序列的過(guò)程如下：[0027]以pLenti6載體為模板，擴(kuò)增出含有大腸桿菌ccdB致死基因的片段，將擴(kuò)增的到的ccdB基因片段用Xhol和MluI雙酶切后，與經(jīng)過(guò)Xhol和MluI雙酶切的pLVX-hU6/Hl/7SK-EFla-copGFP-PGK-Puro線性載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂LB/amp平板，培養(yǎng)過(guò)夜，進(jìn)行菌落PCR及酶切鑒定，得到載體pLVX-hU6/Hl/7SK-ccdB-EFla-copGFP-PGK-Puro〇[0028]所述的shRNA的表達(dá)載體的制備方法，其中，插入shRNA的過(guò)程如下：[0029]用BsmBI單酶切shRNA慢病毒干擾載體pLVX-hU6/Hl/7SK-ccdB-EFla-copGFP-PGK-Puro,得到pLVX-hU6/Hl/7SK-EFla-copGFP-PGK-Puro載體骨架；將退火合成的shRNA序列與pLVX-hU6/Hl/7SK-EFla-copGFP-PGK-Puro載體骨架通過(guò)相應(yīng)的酶切位點(diǎn)連接；轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞stable3,涂LB-Amp平板培養(yǎng)過(guò)夜，隨機(jī)挑取一個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序，構(gòu)建得到表達(dá)shRNA的慢病毒干擾載體pLVX-hU6/Hl/7SK-shRNA-EFla-copGFP-PGK-Puro。[0030]所述的shRNA的表達(dá)載體的制備方法，其中，用于擴(kuò)增hU6啟動(dòng)子的寡核苷酸引物為hU6-ClaI-F:5'-CCATCGATGGAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3'，hU6-XhoI-R:5'-CCGCTCGAGCGGTCGTCCTI當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 4