一種過(guò)表達(dá)海棲熱袍菌乙酰乳酸合酶催化亞基的菌株的構(gòu)建及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體設(shè)及到一種用于催化合成（R)-苯基乙酷甲醇 (R-PAC)及其類似物的菌株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] (R)-苯基乙酷甲醇（R-PAC)是醫(yī)藥工業(yè)中合成a/0-腎上腺素的前體物質(zhì)， 也被用來(lái)合成心麻黃堿化-e地e化ine)、偽麻黃堿（Pseudoe地e化ine)W及苯丙醇胺 (Nore地e化in)等藥物，同時(shí)它也是有機(jī)合成過(guò)程中常用的一種手性中間體，可用于手性藥 物的合成。R-PAC目前利用生物轉(zhuǎn)化法制備，主要是W酵母細(xì)胞來(lái)催化丙酬酸與苯甲醒之間 的縮合反應(yīng)，但由于反應(yīng)速率小及底物轉(zhuǎn)化為目標(biāo)化合物的轉(zhuǎn)化率低使得該方法并不是一 個(gè)非常有效的R-PAC合成途徑。因?yàn)樵摲磻?yīng)中起到催化作用的酶為丙酬酸脫簇酶（PDC)， 故純化后的PDC也已被用來(lái)制備R-PAC，主要有運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌狂ymomonasmobilis) PDC狂mroC)及釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae)PDC(ScPDC)。ScPDC催化活性較 高，但穩(wěn)定性不好；ZmPDC顯示較好的穩(wěn)定性，但催化效率較低。用PDC作為催化劑制備 R-PAC還有一個(gè)比較致命的問(wèn)題，那就是PDC可W催化丙酬酸脫簇形成乙醒，而乙醒的積累 則會(huì)對(duì)PDC酶產(chǎn)生不可逆的抑制，從而極大地影響R-PAC的生成。
[0003] 乙酷乳酸合酶（AHA巧是微生物及高等植物中支鏈氨基酸，如鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸和異 亮氨酸等生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，AHAS通常由兩個(gè)大亞基（也稱催化亞基）及兩個(gè)小亞 基（也稱調(diào)節(jié)亞基）構(gòu)成，其大亞基通常起催化作用，而小亞基則主要起到穩(wěn)定大亞基及調(diào) 節(jié)大亞基活性的作用。高等植物中AHAS酶表達(dá)量低且純化后穩(wěn)定性較差；微生物中AHAS廣 泛存在。常見微生物大腸桿菌巧.COli)中存在=種AHAS同工酶，分別稱為AHASI、II及 III，其中WAHASI在所有微生物源的AHAS中催化活性最好。AHAS是一種典型的焦憐酸硫 胺素（ThP巧依賴酶，在化PP存在下，AHAS可催化一分子丙酬酸與另一份子丙酬酸縮合形成 乙酷徑酸，也稱2-乙酷乳酸，該物質(zhì)是支鏈氨基酸鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸的生物合成前體；同時(shí)該 酶還能催化一分子丙酬酸與一分子下酬酸反應(yīng)生成2-乙酷-2-徑下酸，該化合物則是支鏈 氨基異亮氨酸的生物合成前體；此外，AHAS還能催化丙酬酸與苯甲醒之間的反應(yīng)，立體選 擇性地生成R-PAC。正因?yàn)槿绱?，大腸桿菌AHASI及II分別被用來(lái)催化合成R-PAC僅化gel etal.，Biotechnol.Bioeng.，2003, 83:833-840 ;2004, 88:825-831)。研究表明，AHASI及 II不僅可W有效地催化R-PAC的合成，副反應(yīng)少，底物轉(zhuǎn)化率高，而且受體底物譜寬，可利 用多種取代的芳香族醒為底物合成R-PAC的類似物。但該反應(yīng)也存在缺點(diǎn)：①如前所述， AHAS通常由兩個(gè)大亞基及兩個(gè)小亞基構(gòu)成，在制備該酶時(shí)要同時(shí)制備運(yùn)兩個(gè)亞基然后進(jìn)行 體外重構(gòu)才能獲得，運(yùn)就使得酶制備過(guò)程顯得繁復(fù)；②E.COliAHAS通常穩(wěn)定性較差，其大 亞基單獨(dú)存在時(shí)雖然也顯示較弱的催化活性，但穩(wěn)定性更差。運(yùn)兩個(gè)不足之處很大程度上 限制了E.COliAHAS在催化合成R-PAC及其類似物方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種可用于催化合成（R)-苯基乙酷甲醇（R-PAC)及其類似物的菌 株的構(gòu)建方法，進(jìn)而可W實(shí)現(xiàn)W該重組菌株為催化劑立體選擇性地制備R-PAC及其類似 物。 陽(yáng)0化]本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種過(guò)表達(dá)海棲熱袍菌乙酷乳酸合酶催化亞基的菌株的構(gòu)建方法，包括W下步 驟：
[0007] 1)根據(jù)海棲熱袍菌乙酷乳酸合酶催化亞基（TmAHAS-CSU)的基因序列設(shè)計(jì)上下游 引物，其中上游引物帶有NdeI酶切位點(diǎn)，下游引物帶有Ba恤I酶切位點(diǎn)，具體如下：
[0008] 上游引物：GGAATTCCATATGATGCTTCTGGACGAGATC
[0009] 下游引物：CGCGGATCCTCATACTTTCCCCTCCCTAC
[0010] W上引物中，下劃線部分為限制性內(nèi)切酶的識(shí)別序列； W11] 。W海棲熱袍菌基因組DNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)得到目的基因； 陽(yáng)01引 3)將目的基因連接到祀T28a原核表達(dá)載體上，得到重組質(zhì)粒pET28a-TmAHAS-CSU；
[0013] 4)通過(guò)熱擊法將重組質(zhì)粒祀T28a-TmAHAS-CSU轉(zhuǎn)化入E.COli感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建 過(guò)表達(dá)Tm-AHAS-CSU蛋白的重組菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU。
[0014] 其中步驟4)中，重組質(zhì)粒祀T28a-TmAHAS-CSU的轉(zhuǎn)化具體可按照W下方法進(jìn)行：
[0015] 4. 1)所用E.COli感受態(tài)細(xì)胞為E.COliRosetta值E3)或E.COliBL21 〇)E3);
[0016] 4.。取感受態(tài)細(xì)胞100-300yL伽600 = 0. 1-0. 4)，置于冰上緩慢融化；
[0017] 4. 3)取重組質(zhì)粒祀T28a-TmAHAS-CSU20-5化g，加入到已融化的感受態(tài)細(xì)胞中， 緩慢吹吸混勻，冰上靜置20-40min;
[0018] 4. 4)之后將其放入40-45°C水浴中熱擊80-lOOs后，再放置冰上冰浴2-5min;
[0019] 4. 5)向轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細(xì)胞中加入600-1000yL的LB培養(yǎng)基，放置于恒溫?fù)u床 上，100-120巧m、34-40°C培養(yǎng) 1-化；
[0020] 4. 6)將所得菌液收集并于2800-330化pm離屯、2-5min，棄去上清即得過(guò)表達(dá) Tm-AHAS-CSU的重組菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU。
[0021] 經(jīng)證實(shí)，上述過(guò)表達(dá)海棲熱袍菌乙酷乳酸合酶催化亞基的菌株，具有W下重要用 途：該菌株可直接用于立體選擇性地催化合成R-苯基乙酷基甲醇（R-PAC)或其類似物；所 述類似物為W下=類中任意一種化合物：
[0022] 第一類 R為面素、硝基、徑基、烷氧基或者控基，取代位置為鄰 / 位、間位或?qū)ξ唬?br>[002引第二類R為H、面素、硝基、徑基、烷氧基或者控基，取代位置為甲 酷基的鄰位、間位或?qū)ξ唬?br>[0024]第三類:R為H、面素、硝基、徑基、甲氧基或者控基，取代位置為甲
f 酷基的鄰位或間位。
[00巧]相應(yīng)的催化合成R-苯基乙酷基甲醇（R-PAC)或其類似物的方法也分為W下S類：
[00%] 第一類催化合成反應(yīng)為
[0027]
[0028] 該反應(yīng)中，供體底物為丙酬酸，受體底物為苯甲醒巧=H)，則產(chǎn)物為R-苯基乙酷 基甲醇（R-PAC);或者受體底物為取代的苯甲醒，其中R為面素、硝基、徑基、烷氧基或者控 基，取代位置為鄰位、間位或?qū)ξ?，產(chǎn)物為R-苯基乙酷基甲醇（R-PAC)的第一類類似物。
[0029] 第二類催化合成反應(yīng)為
[0030]
[0031] 該反應(yīng)中，供體底物為丙酬酸，受體底物為化晚甲醒巧=H)或取代的化晚甲醒， 其中對(duì)于所述取代的化晚甲醒，取代基R為面素、硝基、徑基、烷氧基或者控基，取代位置為 甲酯基的鄰位、間位或?qū)ξ唬划a(chǎn)物為R-苯基乙酷基甲醇（R-PAC)的第二類類似物。
[0032] 第=類催化合成反應(yīng)為：
[0033]
[0034] 該反應(yīng)中，供體底物為丙酬酸，受體底物為巧喃甲醒巧=H)或取代的巧喃甲醒， 其中對(duì)于所述取代的巧喃甲醒，取代基R為面素、硝基、徑基、甲氧基或者控基，取代位置為 甲酯基的鄰位或間位；產(chǎn)物為R-苯基乙酷基甲醇（R-PAC)的第S類類似物。
[0035] 上述催化合成反應(yīng)具體可通過(guò)W下方法實(shí)現(xiàn)：
[0036] 在1. 0-3. 0血反應(yīng)混合物中含有20-80mM供體底物、10-40mM受體底物、 50-100mM(pH7. 0-8. 5)的肥陽(yáng)S或PBS或Tris-肥 1 緩沖液、0. 5-5mMThPP、I-IOmMMgClz、 50-lOOmMKC1、0. 25-2.OmMDTT、W及 1-20%DMSO;
[0037] 反應(yīng)混合物在50-90 °C預(yù)解育5-15min后，加入100-300mg重組菌株 Ecoli-Tm-AHAS-CSU引發(fā)反應(yīng)并在同樣的溫度下繼續(xù)解育0. 5-3小時(shí)；
[0038] 然后，離屯、收集上清液，用氯仿或乙酸乙醋萃取2-3次，有機(jī)相合并后W無(wú)水M拆〇4 或無(wú)水Na2S〇4干燥，過(guò)濾除去固形物，濾液于25-45°C下減壓蒸干，所得殘余物用硅膠柱進(jìn) 行純化，洗脫劑為石油酸-乙酸乙醋V/V，3:1。
[0039] 本發(fā)明具有W下有益效果： W40] 本發(fā)明構(gòu)建的菌株可W被直接用于催化反應(yīng)，而無(wú)需純化TmAHAS-CSU蛋白。運(yùn)是 由于該菌株所過(guò)表達(dá)的Tm-AHAS-CSU蛋白具有極佳的熱穩(wěn)定性，且只有在70-90°C的范圍 內(nèi)才具有較強(qiáng)的催化活性，而在運(yùn)樣的反應(yīng)溫度下，菌株中其它蛋白都已變性，不會(huì)對(duì)反應(yīng) 產(chǎn)生任何影響。
[0041] 該構(gòu)建方法的各個(gè)環(huán)節(jié)均能夠通過(guò)常用的基因工程技術(shù)完成。
【附圖說(shuō)明】
[0042] 圖1為編碼Tm-AHAS-CSU基因的克隆（A)及重組質(zhì)粒祀T28a-TmAHAS-CSU的構(gòu)建 度)。
[0043] 圖2為重組菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果。
[0044] 圖3為重組菌株Ecoli-Tm-AHAS-CSU的活性測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】 W45] 海棲熱袍菌（Thermotogamaritime