一株具有菲降解功能的根表成膜細菌rs2及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境多環(huán)芳控（PAHs)污染生物修復領域，設及一株具有菲降解功能 的根表成膜細菌RS2及其應用。
【背景技術】
[0002] 多環(huán)芳控（PAHs)是由2個或2個W上苯環(huán)組成的上壤環(huán)境中常見的一類持久性 有機污染物，其具有慢性毒性和致"效應，疏水性強，難于降解。環(huán)境中的PAHs可W通 過植物吸收進入植物體內(nèi)，在植物器官、組織、細胞、和基因水平上對植物的正常生理活動 產(chǎn)生影響，引起植物體內(nèi)的氧化脅迫，甚至導致細胞死亡。此外，PAHs可W通過食物鏈傳遞 進而威脅人體健康。因而，如何減低植物PAHs污染風險是當前農(nóng)業(yè)環(huán)境領域研究的熱點之 〇
[0003] 通過添加外源化學試劑可m周控植物對PAHs的吸收代謝和積累，從而控制植物 PAHs污染風險，但是外源化學試劑的環(huán)境安全性尚待評價。利用微生物降解有機污染物是 近幾十年興起的環(huán)境污染修復技術。該技術和傳統(tǒng)的物理、化學方法相比，具有很多無可比 擬的優(yōu)點，如處理效果好，操作簡便，適合有毒有害有機污染物大面積面源污染的修復，修 復費用較低，且不產(chǎn)生二次污染等。在國內(nèi)外，微生物修復技術已經(jīng)廣泛應用于環(huán)境有機污 染物的清除，而將微生物與植物聯(lián)合使用通常會得到更好的修復效果，例如菌根真菌和植 物內(nèi)生細菌等。但迄今為止，有關利用根表成膜細菌和植物聯(lián)合修復有機污染的研究報道 很少，該研究仍亟待開拓。
[0004] 細菌生物膜是附著在載體表面或不同介質(zhì)界面的高度組織化、系統(tǒng)化的微生物膜 性聚合物，是細菌在自然環(huán)境中普遍存在的一種生存方式。植物根表普遍存在細菌成膜作 用，根表細菌生物膜是很多根際細菌常見的一種生存方式。根表成膜細菌可W產(chǎn)生植物激 素，促進作物增產(chǎn)，提高植物對礦物質(zhì)的吸收，同時能通過產(chǎn)生抗生素等次生代謝產(chǎn)物，協(xié) 助植物抵御病原菌侵害。根表細菌生物膜的特有結構如EPS可W富集根際環(huán)境的有機污染 物，而生物膜內(nèi)多種細菌的協(xié)同作用W及功能基因的水平轉移等機制則可W強化細菌生物 膜對有機污染物的代謝，進而加速有機污染物的降解。但迄今為止，有關利用根表成膜細菌 降解PAHs的專利研究和應用尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的是針對上述技術問題，提供一種具有菲降解功能的根表成膜細菌 (W下簡稱功能細菌）。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是提供該功能細菌生產(chǎn)的菌劑。
[0007] 本發(fā)明的又一目的是提供該功能細菌在降低植物菲污染風險中的應用。
[0008] 本發(fā)明的目的可通過W下技術方案實現(xiàn)：
[0009]功能細菌銷氨醇菌（S地ingobium sp. )RS2,2015年6月16日保藏于中國微生物 菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，菌種保藏號為CGMCC NO. 10982。
[0010] -種用所述的銷氨醇菌（S地ingobiumsp. )RS2所生產(chǎn)的功能細菌菌劑，是通過w 下方法生產(chǎn)而成：
[0011] 1)將保藏編號為CGMCCNO. 10982的銷氨醇菌RS2試管種接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，振 蕩培養(yǎng)至對數(shù)期； 陽01引。將上述培養(yǎng)好的菌種按5%的接種量（V/V，W培養(yǎng)基體積為基準，下同）接種入 種子罐，培養(yǎng)至對數(shù)期；
[0013] 3)將種子液按10 %的接種量接入生產(chǎn)罐培養(yǎng)；
[0014] 4)在種子罐和生產(chǎn)罐的培養(yǎng)過程中無菌空氣的通氣量為1:1~1. 2,攬拌速度為 180~220轉/分，培養(yǎng)溫度為28~30°C，全流程培養(yǎng)時間為55~60小時，發(fā)酵結束后菌 體數(shù)量達到10億個/mlW上；
[0015] 其中，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，種子罐所用的培養(yǎng)基和生產(chǎn)罐所用的培養(yǎng)基相同，配方 均為：
[0016] 蛋白腺 10.Og? 1 - 1，酵母 5.Og?L- 1，化C1 10.Og?L- 1，抑 7. 0 - 7. 4 ;
[0017] 5)發(fā)酵完成后培養(yǎng)液出罐，用發(fā)酵培養(yǎng)基調(diào)節(jié)培養(yǎng)液濃度至0D600nm= 1. 0,即為 所述的降解菌劑。
[0018] 所述的保藏編號為CGMCCNO. 10982的銷氨醇菌（S地ingobiumSP.)RS2在降解菲 的應用；優(yōu)選所述的銷氨醇菌（S地ingobiumsp. )RS2在降解水體，±壤^及植物體內(nèi)菲的 應用。
[0019] 本發(fā)明所述的降解菌劑在降解菲中的應用；優(yōu)選所述的降解菌劑在降解水體，± 壤或植物體內(nèi)菲的應用。
[0020] 有益效果
[0021] 本發(fā)明篩選獲得一株銷氨醇菌（S地ingobiumsp.)RS2(CGMCCNO. 10982)，利用該 菌株制備的菌劑在實驗室搖瓶培養(yǎng)條件下2d內(nèi)對初始濃度為lOOmg?L1的菲降解率可達 95%W上。菌株RS2具有良好的成膜能力，利用綠色巧光蛋白基因（g巧）對其標記后，W浸 種方式將菌株定殖于植物根表后將植物種植于受菲污染的±壤中，發(fā)現(xiàn)菌株RS2可在植 物根表形成細菌生物膜，且可進入植物內(nèi)部。菌株RS2在根表的定殖成膜能夠有效減低植 物體的菲污染風險，在短時間內(nèi)可使植物根部的菲含量降低40%，且對于植物地上部的去 除效果尤為顯著，可達60%W上；同時，菲在植物體內(nèi)的積累量和傳導系數(shù)也有明顯降低。
[0022] 本發(fā)明描述的環(huán)境修復菌劑可W用發(fā)酵工業(yè)通用發(fā)酵設備進行生產(chǎn)，具有生產(chǎn)成 本低，使用方便，去除效果好的優(yōu)點，可直接用于減低PAHs污染水體，±壤^及植物體內(nèi)的 菲污染風險，具有廣闊的產(chǎn)業(yè)前景和重要的環(huán)境、經(jīng)濟和社會效益。本發(fā)明描述的環(huán)境修復 菌劑為在PAHs污染區(qū)生產(chǎn)健康的農(nóng)產(chǎn)品提供了技術支持，同時對于保障PAHs污染環(huán)境下 的農(nóng)產(chǎn)品安全具有重要意義。
【附圖說明】
[0023] 圖1菌株RS2的菌落照片和透射電鏡照片
[0024]A圖為菌株RS2的菌落照化B圖為菌株RS2的透射電鏡照片 陽02引 圖2菌株RS2WlOOmg?L1菲為唯一碳源時的生長和降解曲線 陽0%] 圖3菌株RS2在LB培養(yǎng)基中的成膜能力
[0027]圖4菌株45 -RS2的巧光顯微照片 陽02引圖5菌株45 -RS2在紫花首猜根表的定殖成膜 [0029] 生物材料保藏信息 陽030] 功能細菌RS2,銷氨醇菌Sphingobiumsp.，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會普通微生物中屯、（CGMCC)，地址為中國北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生 物研究所，保藏編號為CGMCCNO. 10982,保藏日期為2015年6月16日。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1菌株的分離和鑒定
[0032] 采集江蘇省南京市某芳控廠排污口區(qū)附近的主要代表性健康植物樣品（小飛蓬、 車前草、始膜草等）。將采集的植物樣品用滅菌毛刷輕輕去除植物根表泥上后，將其置于裝 有5mL滅菌超純水的離屯、管中劇烈震蕩30s，W破壞根表細菌生物膜結構使細菌游離出來， 獲得的細菌懸液作為根表生物膜中的細菌群落備用。 陽03引 W5%的接種量將上述獲得的細菌懸液加入到lOOmL的無機鹽培養(yǎng)基中，并添加 菲至lOOmg'L-1作為唯一碳源，于30°C，18化'min-1搖床培養(yǎng)7d，W5%的接種量轉接到相 同的培養(yǎng)基中，連續(xù)轉接=次后，梯度稀釋富集液，取1〇4 -1〇~7稀釋度的富集液各0.ImL涂 布于添加lOOmg'1/1菲的無機鹽平板上，于30°C恒溫培養(yǎng)3d后，在紫外燈下觀察，挑選菌落 周圍出現(xiàn)明顯水解圈的菌株，通過劃線分離純化得到單菌落。進一步挑取長出的單菌落接 種于含有l(wèi)〇〇mg'L~i菲的無機鹽液體培養(yǎng)基中，于30°C，180rmin搖床培養(yǎng)7d，驗證其對 菲的降解效果。無機鹽培養(yǎng)基配方為：NH4NO3I.Og?L- 1，KH2PO4O. 5g?L- 1，K2HPO4I. 5g?L- 1， 化Cl1.Og?L-i，M拆O4? 7&00. 2g?L-i，pH7. 0 ;固體培養(yǎng)基加 16g?L-i瓊脂。
[0034] 降解效果的驗證方法：向培養(yǎng)液中加入等體積色譜甲醇后，超聲處理30min，使瓶 中菲全部溶解，12000rmirTi離屯、去除沉淀后取上清液用濾膜過濾（孔徑0.22ym)，用高效 液相色譜法測定其中的菲含量。高效液相色譜（島津LC- 20AT，檢測器型號SPD- 20A)設 定參數(shù)為：Ine;rtsil0DS-SP-C18反相色譜柱（150mmX4.6mm，5ym)，流動相為甲醇：水 =90:10,流速0. 90血'min-1，柱溫40°C，紫外檢測波長245皿，進樣量10y1。外標法按峰 面積定量。
[0035] 從富集液中分離到一株菲降解細菌，命名為菌株RS2。菌株RS2降解菲前后的液 相色譜檢測結果表明菌株RS22d內(nèi)對初始濃度為lOOmg? 1/1的菲降解率大于95%。菌 株RS2在固體培養(yǎng)基上生長2d后，菌落為圓形、較小、外形隆起、光滑、邊緣整齊、有光澤、 呈淡黃色。在透射電子顯微鏡下該菌呈短桿狀，單鞭毛，不形成芽抱。（T，好氧生長，其生 理生化特性見表1。菌株RS2的形態(tài)和生理生化特征和Berg巧'Smanualofsystematic bacteriology上對銷氨醇菌（S地ingobiumsp.)的描述是一致的。
[0036]W菌株RS2的基因組DM為模板，用細菌16SrRNA基因序列通用引物進行PCR擴 增，得到長度為1400bp的16SrRNA基因序列（GenBank登錄號為KP900972)。在畑P數(shù)據(jù)庫 化ttps: