螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定性改造的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及采用基因工程的方法提高酶熱穩(wěn)定性的方法，特別涉及利螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定性改造用的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]熒光素酶(firefly luciferase, LUC )是生物體內(nèi)催化熒光素或者脂肪醛氧化發(fā)光的一類酶的總稱。螢火蟲熒光素酶是一種能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能的高效生物催化劑。早在1884年，Dubois發(fā)現(xiàn)將螢火蟲研磨后熒光很快會(huì)消失，添加螢火蟲尾部的新鮮提取物后又能重現(xiàn)熒光。此后，他證實(shí)提取物中存在熒光素和熒光素酶的相互作用，并指出在有氧分子、ATP的條件下，蟲光素酶可催化熒光素氧化并發(fā)出便于靈敏檢測(cè)的熒光。其化學(xué)反應(yīng)如下:
熒光素+ ATP + O2 =氧化熒光素+ AMP + PPi + CO2 +光在有過量酶和過量底物存在的條件下，發(fā)光強(qiáng)度與反應(yīng)中存在的ATP量成正比。這種發(fā)光特性使得螢火蟲熒光素酶在各種測(cè)定ATP的研究和生產(chǎn)中廣泛使用，目前，螢火蟲熒光素酶已被用作生物傳感器，開發(fā)成ATP快速檢測(cè)試劑盒，用于快速檢測(cè)血液、奶粉、食品生產(chǎn)線、醫(yī)療環(huán)境等樣本中污染的細(xì)菌細(xì)胞。目前市場(chǎng)上所售的熒光素酶多從螢火蟲尾部提取，易受到地域和季節(jié)的限制，且繁殖周期長(zhǎng)，養(yǎng)殖成本高，分離純化復(fù)雜。利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)熒光素酶具有周期短、不受季節(jié)、地域影響、成本低、過程易于規(guī)范控制等諸多優(yōu)點(diǎn)，受到了人們的廣泛關(guān)注。早在1985年，JefTery等人首次克隆了螢火蟲熒光素酶基因，并構(gòu)建了含蟲光素酶基因的重組載體pkwlOI，在方.cWi中成功實(shí)現(xiàn)表達(dá)，獲得了具有活性的熒光素酶。1993年，Lu等人構(gòu)建了一株可高效分泌熒光素酶的大腸桿菌，從而使得基因工程菌規(guī)?；a(chǎn)熒光素酶成為可能。目前，Promega, Sigma以及沈陽中科靚馬公司已相繼推出來自于大腸桿菌基因工程菌的熒光素酶。但與來自于螢火蟲的熒光素酶相比，利用基因工程的方法生產(chǎn)的熒光素酶存在熱穩(wěn)定性較差等缺陷，嚴(yán)重制約了熒光素酶的應(yīng)用。
[0003]本發(fā)明利用基因工程的方法對(duì)螢火蟲熒光素酶進(jìn)行改造，通過N、C末端融合表達(dá)label 1、label2，基于label 1、label2共價(jià)結(jié)合的特性，改變熒光素酶的現(xiàn)有結(jié)構(gòu)，以提高螢火蟲熒光素酶的熱穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的技術(shù)目的之一在于提供一種基因工程的方法，從而解決酶穩(wěn)定性差的缺陷；
本發(fā)明的另一技術(shù)目的在于提供一種基因序列，該序列可通過表達(dá)載體轉(zhuǎn)入工程菌中，從而表達(dá)生成螢火蟲熒光素酶，該螢火蟲熒光素酶粗酶液熱穩(wěn)定性可明顯提高，從而解決螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定性差的缺陷。
[0005]進(jìn)一步的，為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為: 一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，包括在現(xiàn)有基因的N端至少連接如Iable I所述的序列，且在同一基因的C端至少連接如Iable 2所述的序列，其中，label 1、label2能夠共價(jià)結(jié)合，Iable I 與 Iable 2 的序列如 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
[0006]一種能夠表達(dá)合成螢火蟲熒光素酶的多核甘酸序列，其序列如SEQ ID N0.3所示。
[0007]本方案中包含了上述核苷酸序列的重組表達(dá)載體。
[0008]在一個(gè)優(yōu)選的載體T-1abel 1-1 inker-f1-1inker-1abel 2中，可采用如下步驟構(gòu)建獲得:
(1)以IabeII基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物I和引物2，通過PCR的方法獲得C端連有I inker的 label I 的 PCR 產(chǎn)物，命名為 label 1-1inker ；
(2)以熒光素酶基因fl為模板，設(shè)計(jì)引物3和引物4，通過PCR的方法，獲得N端連有l(wèi)inker的熒光素酶基因fl的PCR產(chǎn)物，命名為I inker-f I ;
(3)步驟(1)、(2)獲得的PCR產(chǎn)物混合，作為模板，以引物1、4進(jìn)行PCR獲得label1-linker-fl，膠回收 PCR 產(chǎn)物；
(4)以熒光素酶fl基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)引物5和引物6，通過PCR的方法獲得C端連有l(wèi)inker的熒光素酶基因fl的PCR產(chǎn)物，命名為f1-1inker ;
(5)以label2為模板，設(shè)計(jì)引物7和引物8，通過PCR的方法，獲得N端連有l(wèi)inker的 label 2 的 PCR 產(chǎn)物，命名為 Iinker-1abel 2 ；
(6)步驟(4)、(5)獲得的PCR產(chǎn)物混合，作為模板，以引物5、8進(jìn)行PCR獲得fl-linker-label 2，膠回收 PCR 產(chǎn)物;
(7)步驟(3)、(6)獲得的PCR產(chǎn)物混合，作為模板，以引物1、8進(jìn)行PCR獲得label1-1 inker-f 1-linker-labe I 2，膠回收 PCR 產(chǎn)物；連接 PMD19-T Vector，得到重組載體T-1abel 1-1inker-f1-1inker-1abel 2。
[0009]其中，上述各步驟引物序列:
引物 I 序列:GGAATTCCATATGCTTATCAGTTAGTACATGGAAAG，
引物 2 序列:AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGAATCTTTGCCG ；
引物 3 序列:CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAATTATGGAAGACGC ；
引物 4 序列:CAATTTGGACTTGCCGCCTTTTTTA ；
引物 5 序列:ATGGAAGACGCCAAAAATATCAAA，
引物 6 序列:AATTCAGCTCGCATGGGCTATTACGCCAAAGCAAITTGGACTTG ；
引物 7 序列:CTTTGGCGTAATAGCCCATGCGAGCTGAAT，
引物 8 序列:CCGCTCGAGGTTTGGTTGTATGATCCTAG。
[0010]本發(fā)明還提供了含有上述重組表達(dá)載體T-1abel 1-1 inker-f1-1inker-1abel 2的大腸桿菌工程菌。
[0011]通過現(xiàn)有的發(fā)酵方法，可以在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵上述大腸桿菌工程菌以獲得含有螢火蟲熒光素酶的粗酶液。
[0012]利用該粗酶液，可以在不超過60°C的溫度下，催化熒光素反應(yīng)產(chǎn)生熒光。
[0013]其中，上述發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基為:大豆蛋白胨10~12 g/L，葡萄糖10~20 g/L，Na2HPO4 4-6 g/L, K2HPO4 1-3 g/L, NH4Cl 0.5~1 g/L, NaCl 0.1-0.5 g/L, MgSO4.7H20
0.1-0.5 g/L, AMP，luL/MLo
【附圖說明】
[0014]圖1 label 1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 構(gòu)建過程。
[0015]圖 2 pET22b_label 1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 構(gòu)建過程。
[0016]圖3 pET22b_label 1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 質(zhì)粒酶切電泳圖。
[0017]圖4改造前后熒光素酶SDS-PAGE圖；
其中，WT:未改造的焚光素酶；label l_fl_lable 2:在焚光素酶C端、N端添加lableK Iable 2 標(biāo)簽；label l-fl-lable -mutant 在焚光素酶 C 端、N 端添加 lable K Iable 2突變后的標(biāo)簽，使得Iable K Iable 2無法發(fā)生共價(jià)結(jié)合。
[0018]圖5改造前后的螢火蟲熒光素酶熱穩(wěn)定性比較。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照本領(lǐng)域的公知手段。
[0020]實(shí)施例1螢火蟲熒光素酶基因重組載體pET22b_label1-1 inker-f 1-linker-labe I 2 的構(gòu)建過程
label 1-1 inker-f 1-1 inker-label 2構(gòu)建過程的示意圖如圖1所示，具體的步驟為:
(I)以IabeI I基因?yàn)槟０澹O(shè)計(jì)引物I和引物2，通過PCR的方法獲得C端連有I inker的 label I 的 PCR 產(chǎn)物，命名為 Iabel-1inker ；
PCR體系為:2XTaq Plus master mix (Taq酶預(yù)混合溶液)12.5 uL，模板DNA 2 uL，引物 I I uL，引物 2 I uL，ddH20 8.5 uL。PCR 反應(yīng)進(jìn)程為:I) 95°C預(yù)變性 5 min ；2) 94°C預(yù)變性30 s;3)55°C退火30 s;4)72°C延伸1.5 min ;步驟2)-4)重復(fù)29個(gè)循環(huán)；5) 72°C繼續(xù)延伸30 s，冷卻至4°C。膠回收PCR產(chǎn)物。
[0021](2)以熒光素酶基因fl為模板，設(shè)計(jì)引物3和引物4，通過PCR的方法(退火時(shí)間按1000 bp/min設(shè)計(jì)，其余同上)，獲得N端連有l(wèi)inker的熒光素酶基因fl的PCR產(chǎn)物，命名為 I inker-f I ；
(3)步驟(1)、(2)獲得的PCR產(chǎn)物混合，作為模板，以引物1、4進(jìn)行PCR獲得label1-linke