生產(chǎn)除草劑-抗性甜菜植物的方法
【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)對除草劑（例如乙酰輕酸合成酶（ALS，acetohydroxyacid synthase enzyme)的抑制劑）有抗性的甜菜（糖用甜菜，sugar beet)植物的方法。
[0002] 本發(fā)明進一步涉及通過該方法獲得的植物。
【背景技術(shù)】
[0003] 甜菜在溫帶和亞熱帶地區(qū)是一種重要的農(nóng)業(yè)作物。
[0004] 在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中，除草劑被廣泛地用于管理雜草增殖。
[0005] 通過使用轉(zhuǎn)基因方法可以進行對一種或多種除草劑（如ALS抑制劑）有抗性的甜 菜植物的生產(chǎn)（開發(fā)，develop)。
[0006] 實際上，在各種大田作物中，包括在甜菜中，已經(jīng)成功地完成了外源DNA的引入， 該外源DNA攜帶賦予對除草劑的抗性的基因。
[0007] W095/10178公開了一種轉(zhuǎn)基因誘導的對除草劑雙丙氨膦（bialaphos)的抗性。 在甜菜的保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體中引入編碼該抗性的基因，隨后將這些原生質(zhì)體再生為甜菜植 物。那些植物進一步對化學草胺膦和其衍生物草銨膦有抗性。
[0008] 未轉(zhuǎn)化植物無法獲取對雙丙氨膦的抗性。
[0009] 最佳地，83000原生質(zhì)體再生成28個轉(zhuǎn)化的愈傷組織（calli);最差地，190000原 生質(zhì)體再生成1個愈傷組織。隨后，這些愈傷組織中的一些可以示出體細胞胚胎發(fā)生（體 胚發(fā)生，somatic embryogenesis)并且可以再生成甜菜苗，具有1%的效率，而發(fā)現(xiàn)非常有 利的特征是尚達30 %。
[0010] 然而這種方法在本領域中并不常用，該方法廣泛依賴于外植體的愈傷組織的更直 接轉(zhuǎn)化，該外植體獲得自甜菜器官（如胚（胚芽，embryo))和/或葉盤。
[0011] 對于開發(fā)抗除草劑植物（如在甜菜作物中）依然存在重要的需要，并且其不依賴 于DNA載體和/或外源基因的插入。
[0012] 另一方面，通過經(jīng)典育種，利用將含有天然存在的抗性基因的甜菜植物在理論上 可以進行對一種或多種除草劑（如ALS抑制劑）有抗性的甜菜植物的開發(fā)。然而，這樣的方 法是費時的，并且就申請人掌握的知識，該方法沒有導致成功，盡管事實上至少對于除了甜 菜以外的物種（包括各種雜草物種），記載了天然存在的ALS抑制劑-抗性植物。特別地， 雙重突變體（即，在相同的ALS基因中具有兩個突變的植物）在自然界非常不可能產(chǎn)生。
[0013] 專利申請W098/02527公開了一種制備對一些ALS抑制劑（如磺酰脲除草劑）有 抗性的甜菜植物的方法，該方法包括以下步驟：將從甜菜（B. vulgaris)的外植體中獲得的 愈傷組織暴露于磺酰脲，并且從少數(shù)的自發(fā)突變體再生植物，該突變體可以在這種除草劑 存在下生長。
[0014] 這種方法產(chǎn)生在ALS基因中具有突變的植物，其中，編碼的ALS酶的位置188 (對 應于擬南芥（Arabidopsis thaliana)ALS酶的197位置）處的脯氨酸由絲氨酸取代（代 替）。然而，這種突變不是商業(yè)上使用的，因為利用優(yōu)選的現(xiàn)代磺酰脲ALS除草劑（例如，甲 酰胺磺隆）的處理在田間試驗中以必需劑量率表現(xiàn)出一些植物毒性。
[0015] 專利申請W02012/049268依賴于相同方法，不同之處在于從甜菜（B. vulgaris)的 外植體獲得的愈傷組織暴露于甲酰胺磺隆，并因此導致甜菜植物對幾種ALS抑制劑（包括 對甲酰胺磺?。┯锌剐?。
[0016] 這種方法產(chǎn)生在ALS基因中具有突變的植物，其中，編碼的ALS酶的位置569 (對 應于擬南芥（Arabidopsis thaliana)ALS酶的574位置）處的色氨酸由亮氨酸取代。
[0017] 這種純合子569/569突變體的田間試驗示出了對甲酰胺磺隆、對碘甲磺隆（另一 種ALS抑制劑）、以及對不同ALS抑制劑的混合物表現(xiàn)出良好的抗性。
[0018] 這兩種公開的方法受益于從單個外植體（如胚（embryo))中分離愈傷組織的廣為 接受的步驟。然而，這是一種耗時的方法，其涉及（i)分離大量新鮮胚，（ii)將它們重復的 培養(yǎng)在瓊脂凝固培養(yǎng)基上，以及（iii)使用形態(tài)選擇方法選擇可再生的愈傷組織。
[0019] 轉(zhuǎn)移遺傳性狀至甜菜的其它策略已經(jīng)得到發(fā)展并依靠葉肉原生質(zhì)體（其不同于 氣孔保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體）作為起始材料（Krens et al·，1990, Theor. appl. Genet.，vol 79, 390-396)。
[0020] Gurel et al. 2008, Critical reviews in Plant Science, 27, 108-140,公開了甜 菜的生物技術(shù)應用。公開了7種不同的體外培養(yǎng)技術(shù)。其中有原生質(zhì)體的培養(yǎng)，其或者來 自于氣孔保衛(wèi)細胞（用于轉(zhuǎn)化目的）、或者來自于黃化下胚軸外植體的易碎愈傷組織（松散 愈傷組織），后者顯著地更為有效。然而，使用原生質(zhì)體的這種方法與主要的難點相關聯(lián)。
[0021] Hall et al. 1997, J. Exp. Botany, 48, 255-263 已經(jīng)使用 500000氣孔保衛(wèi)細胞原生 質(zhì)體的培養(yǎng)物，用于利用外源DNA進行轉(zhuǎn)化實驗。轉(zhuǎn)化效率高于2%。另一方面，植物的體 外培養(yǎng)被報道與氣孔故障（stomatal failure)相關，指出相應細胞的問題，從而產(chǎn)生很高 量（如進行涉及突變事件的方法所需要的量）的氣孔保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 在廣義方面，本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)對除草劑有抗性的突變甜菜植物的方法，包 括以下步驟：
[0023] -從分離自甜菜植物的氣孔保衛(wèi)細胞（stomatal guard cells)中獲得原生質(zhì)體 (protoplast)；
[0024] -向這些原生質(zhì)體的體外培養(yǎng)物施加組合物，該組合物包含以下濃度的這種除草 劑，該濃度對于大于99%的體外培養(yǎng)細胞是致死的；以及
[0025] -從這些體外培養(yǎng)細胞中的存活細胞（surviving cells)再生甜菜植物，
[0026] -可能地選擇在編碼肽的基因中具有突變的再生甜菜植物，該肽由這種除草劑靶 向，
[0027] 其中，這些氣孔保衛(wèi)細胞原生質(zhì)體針對它們再生為甜菜植物的能力加以預先選 擇，并且其中，向大于20000000的這些原生質(zhì)體施加這種除草劑。
[0028] 在本發(fā)明方法中使用的除草劑可以是不靶向ALS基因的除草劑。
[0029] 優(yōu)選的除草劑（不靶向ALS)選自由以下各項組成的組：
[0030] -4-HPH)抑制劑（如甲基磺草酮、異噁唑草酮、磺酰吡唑醇、雙環(huán)磺草酮、吡草酮、 吡唑特、芐草唑、環(huán)磺酮、苯唑草酮、磺草酮和sulcotrion)，類胡蘿卜素生物合成抑制劑 (如呋草酮、氟啶草酮、氟咯草酮、氟丁酰草胺、氟草敏、氟吡酰草胺和吡氟草胺）；
[0031] -EPSP合酶抑制劑（如草甘膦或草甘膦三甲基硫鹽）；
[0032] -光合體系（磷酸系統(tǒng)，phosphosystem) II抑制劑（如苯基-氨基甲酸酯類 (Phenyl-carbamate)(例如甜菜寧（殺敵草，phenmedipham)或甜菜安（desmedipham))、 t1 達嗪酮類（例如氯草敏（chloridazon)=殺草敏）、三嗪類（例如草凈津（cyanazine)、 草達津（remtal)、甘草津（eglinazine-ethyl)、丙胺津（proglinazine-ethyl)、莠滅 凈（ametryn)、莠去津（atrazine)、敵草凈（atrazine)、異戊乙凈（dimethametryn)、 撲滅通（prometon)、撲草凈（prometryn)、撲滅津（propazine)、西瑪津（simazine)、 西草凈（simetryn)、甲氧去草凈（terbumeton)、特丁津（terbuthylazine)、去草凈 (terbutryn)、methoprotyn)、三嗪酮類（Triazinones)(例如苯嗪草酮（metamitron)、 嗪草酮（metribuzin)、環(huán)嗪酮（hexazinone)、嗪草酮）、脲喃啶類（除草定（bromacil)、 環(huán)草定、特草定）、脲類（噁挫隆（dimefuron)、異丙隆、利谷?。↖inuron)、綠谷隆 (monolinuron)、橫噻隆（ethidimuron)、甲基苯噻隆、丁挫隆（tebuthiuron)、敵草隆 (diuron)、非草隆（fenuron)、草不?。╪eburon)、環(huán)草隆（siduron)、異隆（isouron)、氯 溴隆、綠麥?。╟hlorotoluron)、枯草?。╟hloroxuron)、伏草?。╢luometuron)、秀谷隆 (metobromuron)、甲氧?。╩etoxuron)、噻氣?。╰hiazafluron)、滅草隆（monuron)、環(huán)莠 隆（cycluron)、綠谷隆（monolinuron))、或氨挫草酮（amicarbazone)、蔬草滅（solan)、 敵稗（propanil)、滅草松（bentazon)、溴苯腈（bromoxynil)、碘苯腈（ioxynil)、殺草全 (bromofenoxim)、P達草特（pyridate)、氯苯P達醇（pyridafol);
[0033] -光合體系（磷酸系統(tǒng)，phosphosystem) I抑制劑（如敵草快（diquat)或百草枯 (paraqua))；
[0034] -細胞分裂抑制劑（如草長滅（carbetamide)、氯苯胺靈（chlorpropham)、苯胺 靈（propham)、萘丙胺（naproanilide)、草乃敵（diphenamid)、敵草胺（napropamide)、丁 稀草胺（butenachlor)、吡挫草胺（metazachlor)、乙酰甲草胺（diethatyl-ethyl)、乙草 胺（acetochlor)、甲草胺（alachlor)、丁草胺（butachlor)、毒草胺（Monsanto)、異丙草 胺（propisochlor)、二甲草胺（dimethachlor)、二甲吩草胺（dimethenamid)、異丙甲草 胺（metolachlor)、丙草胺（metolachlor)、S_ 異丙甲草胺、稀草胺（pethoxamid)、噻吩 草胺（thenylchlor)、莎稗磷（anilofos)、挫草胺（cafenstrole)、節(jié)草酮（indanofan)、 溴丁酰草胺（bromobutide)、哌草磷（piperophos)、氟噻草胺（flufenacet)、苯噻草胺 (mefenacet)、四挫酰草胺（fentrazamide));
[0035] -微管組裝抑制劑（如炔苯酰草胺（propyzamide)=拿草特（pronamide)、牧 草胺（tebutam)、敵草索（chlorthal-dimethyl) =DCPA、氣消草（fluchloralin)、胺硝 草（pendimethalin)、地樂胺（butralin)、氟草胺（benefin)=氟草胺（benfluralin)、 乙丁稀氟靈（ethalfluralin)、氨磺樂靈（oryzalin)、氟樂靈（trifluralin)、氨氟樂靈 (prodiamine)、敵樂胺（dinitramine)、草胺磷（butamifos)、氟硫草定（dithiopyr)、噻草 定（thiazopyr))；
[0036] -原卟卩林原氧化酶抑制劑（如二苯醚類（三氟酸草醚鈉（trifluralin)、甲羧 除草醚（bifenox)、氯氟草醚（ethoxyfen-ethyl)、草枯醚（chlornitrofen)、乙羧氟草 謎（fluoroglycofen-ethyl)、乙氧氣草謎（oxyfluorfen)、氯硝謎（chlomethoxyfen)、 三氟硝草醚（fluordifen)、氟黃胺草醚（fomesafen)、乳氟禾草靈（Iactofen)、除草醚 (nitrofen)、苯草謎（aclonifen))、N-苯基釀酰亞胺類（N-phenylphthalimides)(吲噪 酮草酯（cinidon-ethyl)、氟稀草酸（flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺（flumioxazin)、 氟稀草酸（flumiclorac-pentyl))、噁二挫類（丙炔惡草酮（oxadiargyl)、惡草酮 (oxadiazon))、噁挫焼二酮類（環(huán)戊噁草酮（pentoxazone))、苯吡挫類（異丙吡草酯 (fluazolate)、異丙吡草酯、氟挫草酯（pyraflufen-ethyl))、喃啶二酮類（苯喃磺草胺 (saflufenacil)、雙苯喃草酮（benzfendizone)、氣丙喃