切碎后置于1.5mL離心管中。稱量凝膠重量，將該重量作為一個凝膠體積(如100 mg=100 μ L)。向離心管中加入3個凝膠體積的Buffer DE-A,混勻后置于75°C加熱儀上加熱，每2-3 min間斷混合一次，直至凝膠完全融化(時間大約為6-8min)。向離心管中加0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B,混合均勾；將混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2mL離心管)中，12000Xg離心I min，棄濾液。將制備管放回2mL離心管，加500 μ I Buffer Wl，12000Xg離心30 s，棄濾液。將制備管放回2mL離心管，加700 yL Buffer W2，12000Xg離心30 s，棄濾液。以同樣方法再用700 yL Buffer W2洗滌一次，12000Xg離心I Hiin0將制備管放回2mL離心管中，12000X g離心I min。將制備管置于干凈的1.5mL離心管中，在制備膜中央加25-30 μ L Eluent去離子水，室溫下，靜置I min。12000Xg離心I min，洗脫DNA。取2 μ L回收純化后的產(chǎn)物，使用1%瓊脂糖進行凝膠電泳檢測。
[0021]4)目的片段與載體連接
克隆載體為TaKaRa公司的pMD19_T Vector(D102A)，進行連接反應(yīng)，連接體系(10 μ L):5yL Solut1n I，IyL pMD19_T Vector,4yL PCR 純化產(chǎn)物(50 ng)。輕輕吸打混勻后，使用離心機低速離心，水浴鍋中16 °C連接過夜。
[0022]5)大腸桿菌超級感受態(tài)細胞的制備
取置于-80°C超低溫冰箱中保存的JM109菌株，用接種環(huán)取少量，在不含抗生素的LB培養(yǎng)基上進行劃線，37°C培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)12-16 ho參考分子克隆實驗指南，采用Inoue方法制備大腸桿菌JM109超級感受態(tài)細胞，保存于_80°C，備用。
[0023]6)連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
從超低溫冰箱中取出感受態(tài)細胞JM109菌株，置于冰上融化。吸取5 μ L的過夜連接產(chǎn)物加入到100 μ L感受態(tài)細胞中；將離心管置于冰上冰浴30 min ;42°C水浴鍋中水浴，熱激90 S，期間不要搖動；后立即置于冰上冰浴2 min;在超凈臺中加入800 μ L無抗生素的液體培養(yǎng)基，370C、180 rpm搖Ih復(fù)蘇；4000 rpm離心3 min,吸去800 μ L上清；將沉淀的菌體重懸，涂于LB平板(Amp的濃度為100 mg/L)，37°C培養(yǎng)過夜。
[0024]7)重組質(zhì)粒的篩選及驗證
挑取在含有抗生素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上過夜生長的單菌落，接種到含有同樣抗生素的750 μ L的LB液體培養(yǎng)基中。250 rpm, 37 °C過夜培養(yǎng)。
[0025]PCR 擴增體系為:2 μ L 10XPCR Buffer, 1.2 yL MgCl2 (25 mM),0.4yL dNTP (10mM)，I μ L M13-F/R，2 μ L 菌液，0.2 μ L rTaq，ddH20 補充到 20 μ L。
[0026]PCR程序為:94°C5 min ；94°C 30 s,55°C 30 s,72°C I min40 s，36 cycles ；72°C 7min ；4°C forever。
[0027]吸取ΙΟμ?的PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。驗證后，將條帶大小正確的菌液樣品委托上海英駿公司測序，測序引物為通用引物M13F/R。測序結(jié)果在NCBI上進行比對分析。
[0028]根據(jù)對測序結(jié)果的分析，最終確定克隆得到I個雜交鵝掌楸基因，命名為基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，基因，片段長度為1610 bp，含有
ATG起始密碼子和TAA終止密碼子，其中ORF全長為1572 bp，編碼524個氨基酸的蛋白質(zhì)，該蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0029]實施例2
研究結(jié)果表明和在雜交鵝掌楸中各個組織器官中均發(fā)揮重要作用。但是兩個基因在莖中的表達量最高，說明莖的生長發(fā)育中GA信號途徑活躍，DELLA蛋白在莖的伸長生長中起著重要的調(diào)控作用。
[0030]本實施例所用的植物材料為擬南芥thaliana) Col (Columbia)野生型種子，由德國Thomas Laux教授惠贈。
[0031]本實施例所用的大腸桿菌菌株為A coli JM109 ;農(nóng)桿菌菌株為GV3101和EHA105，分別用于轉(zhuǎn)化擬南芥；試驗中所用植物表達載體為PBI121。所有菌株購自相關(guān)生物公司。
[0032]I) LhRGLI基因的pB1121載體的構(gòu)建
將實施例1獲得的基因的ORF全長序列與植物表達載體PBI121進行連接，構(gòu)建的載體如圖1。
[0033]2)質(zhì)粒的提取:采用堿裂解法中量提取質(zhì)粒。所用試劑為-Solut1n 1:50 mM葡萄糖，25 mM Tris-Cl, 10 mM EDTA，ρΗ8.0，高壓滅菌 15 min，4°C保存。Solut1n I1:1ONNaO H 2mL，0.1%SDS 10mL，88mL H20，配制成 100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。Solut1n II1:5mol/L 醋酸鉀 60mL，醋酸 11.5mL，ddH20 28.5mL，配制成 10mL, 4°C保存，用前冰浴(K+為 3 mol/L，AC為 5 mol/L)。
[0034]質(zhì)粒提取的步驟為:取過夜培養(yǎng)的1mL菌液，12000 rpm、2 min離心，收集菌體；倒掉上清液，盡可能去掉培養(yǎng)基；將菌體重懸于400 μ? Solut1n I中，劇烈震蕩，盡可能打散4Ρ 800μ? Solut1n II，快速顛倒離心管(2mL大小的離心管)，將混合后的內(nèi)容物置于冰上；加入6(Κ)μ? Solut1n III，輕輕反復(fù)顛倒數(shù)次，使細菌裂解物分散后置于冰上3_5min -A°C, 14000 rpm離心5 min，取2 X 850μ?上清到兩只潔凈離心管中；加入等體積酸氯仿(可用氯仿代替)，劇烈震蕩混合水相和有機相，14000 rpm離心2 min，取上層水相到另外一只干凈的離心管中(大約SOOPL);室溫下加等體積氯仿:異丙醇，劇烈震蕩混合均勻，室溫放置2 min ;在室溫下最大轉(zhuǎn)速14000 rmp離心5 min，收集沉淀；小心去除上清，將離心管倒置于紙上，流干液體，盡量除去管壁上液體；加入ImL 70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，使沉淀在乙醇中漂浮，室溫下14000 rmp離心2 min ;去除酒精，開口使液體完全揮發(fā)；用30μ?含有RnaseA (20 μδ/μ?)的水進行溶解，4°C保存。
[0035]3)特異酶切位點的添加
以目的基因與克隆載體PMD19-T所構(gòu)建的陽性重組質(zhì)粒為模板，通過PCR方法在目的基因的兩側(cè)添加特異性酶切位點。雜交鵝掌楸ZA似;基因兩側(cè)添加BamHI和SacI酶切位點。PCR反應(yīng)體系、程序及所使用引物如下:
PCR 反應(yīng)體系(20μυ:2μ? 10XPCR Buffer，1.2μ? MgCl2 (25 mM),0.4μ? dNTP (10mM), IlJ-L Forward Primer，IKL Rorward Primer，IKL 質(zhì)粒 DNA，0.2KL rTaq, 13.2? ddH20o
[0036]PCR 反應(yīng)程序:94°C 5 min ；94°C 30 s，55-59。。30 s,72°C I min40 s，36 cycles ；72°C 7 min ；4°C forever。
[0037]所使用的引物序列:
LhRGLl-F+BamH1:5’-GCATCCATCTGCACATCCAAACACACCATTC-3’，
LhRGLl-R+Sac1:5’-GAGCTCACAGCTTATTCTATTGTATCCCGAG-3’。
[0038]將得到的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離，使用AxyPr印DNA Gel Extract1nKit試劑盒進行回收純化，將回收后的產(chǎn)物與pMD19-T Simple連接，構(gòu)建含有目的基因的中間載體。
[0039]4)雙酶切反應(yīng)
使用相應(yīng)的內(nèi)切酶進行酶切反應(yīng)，得到含有粘性末端并覆蓋整個ORF的LhRGlA麵片段。同時用同樣的酶，處理空的PBI121表達載體。酶切反應(yīng)體系:2yL 10XKbuffer, 0.5 yL BamH 1,0.5 yL Sac I，I μ g 回收產(chǎn)物/pBI121 空載體質(zhì)粒，ddH20 補充至Ij20 μ L0 37°C水浴，酶切4-6h。加入1XLoading Buffer緩沖液終止酶切反應(yīng)。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分離檢測，使用AxyPr印DNA Gel Extract1n Kit(AXYGEN)的試劑盒進行回收并純化酶切產(chǎn)物，將其溶于20 μ L的ddH20中。酶切結(jié)果如圖2所示，其中，M:DL2000 Marker 山人與 pMD19_T Simple 連接后用用 BamHI 和 SacI 雙酶切。
[0040] 5)連接反應(yīng)
瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切后所回收到的目的基因和載體PBI121，根據(jù)所檢測出的純度和濃度，按連接體系加入各試劑，16°C過夜連接。其中，目的片段分子數(shù):載體分子數(shù)=3:1-5:1，連接反應(yīng)體系為:2 μ L Τ4 DNA ligase buffer ( 10 X)，2 μ L經(jīng)過酶切的表達載體，10 μ L 目的片段，I μ L Τ4 DNA ligase, ddH20 補充至 20 μ L。
[0041 ] 6 )連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌
將目的片段與載體PBI121連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109超感細胞中，方法同實施例I。
[0042]7)重組子的鑒定
挑取平板上的單菌落接種到含有抗生素(卡那霉素)的LB液體培養(yǎng)基