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      包含包封的antagomir的組合物的制作方法

      文檔序號:9475779閱讀:689來源:國知局
      包含包封的antagomir的組合物的制作方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001] 本發(fā)明設(shè)及旨在預(yù)防或治療屯、臟疾病,包括屯、臟缺血性疾病的藥物制劑的領(lǐng)域。
      【背景技術(shù)】
      [0002] 急性屯、肌梗死(AMI),也稱為屯、肌梗死并通常被稱為屯、臟病發(fā)作,代表世界上大多 數(shù)工業(yè)化國家的一個主要健康風(fēng)險,并且仍然是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因。
      [0003] 通常,AMI是由突然且持續(xù)缺乏流向屯、臟組織的血液造成,運一般是冠狀動脈狹窄 或閉塞的結(jié)果。沒有充分的血液供給,所述組織變得缺血,造成屯、肌細胞(屯、臟肌肉細胞) 和血管結(jié)構(gòu)的死亡。
      [0004] 近幾十年來在治療AMI中有很多進展,主要設(shè)及與藥物療法相結(jié)合的冠狀動脈再 灌注。再灌注療法已經(jīng)通過減少梗死面積和改善短期和長期的發(fā)病率和死亡率而成功改變 AMI的自然進展。然而,使用目前可獲得的兩種再灌注策略有實質(zhì)性的限制:纖維蛋白溶解 導(dǎo)致低程度的冠狀動脈通透性,在AMI進化的開始幾小時期間不能頻繁應(yīng)用初期血管成形 術(shù)。此外,在一些插管的患者中,除了正常的屯、外膜血流,出現(xiàn)"無復(fù)流"現(xiàn)象或缺乏微血管 再灌注,導(dǎo)致不良功能性結(jié)果。運意味著再灌注療法不能預(yù)防屯、肌的有害重構(gòu)(膠原蛋白 瘤痕形成的復(fù)雜的內(nèi)在修復(fù)過程,導(dǎo)致屯、室擴張、收縮功能障礙和隨后的屯、臟衰竭)的發(fā) 生。它在大約30%AMI中的發(fā)生主要與仍知之甚少的較大的梗死面積、微血管阻塞及不良 修復(fù)反應(yīng)有關(guān)。
      [0005] 因為修復(fù)性纖維化和缺血組織的功能恢復(fù)依賴于建立供應(yīng)氧合血的網(wǎng)絡(luò),已經(jīng)做 出努力W通過在愈合區(qū)域誘導(dǎo)新血管形成來改善血管床,從而在原位實現(xiàn)將損傷區(qū)域直接 轉(zhuǎn)變?yōu)楣δ苄越M織。
      [0006] 血管生成的治療性誘導(dǎo)可W減輕運種現(xiàn)象的發(fā)生。盡管如此,若干年靜脈促血管 生成因子的臨床試驗結(jié)果并不令人滿意。不被理論束縛,認為造成運種失敗的原因之一是 靜脈途徑不能夠在嚴重受損的屯、臟條件下到達并在祀組織中維持有效的藥物濃度,從而促 進并維持功能性的血管網(wǎng)絡(luò)。
      [0007] 為了解決運個問題并預(yù)防AMI后的屯、功能不全,在過去十年內(nèi)開始了再生屯、肌和 血管可能性的研究。施用多能祖細胞和灌注血管生長因子的初始研究顯示有前途的結(jié)果, 但轉(zhuǎn)到臨床設(shè)置則顯示運些治療不能W足夠恢復(fù)被破壞的屯、肌的方式再生新血管。
      [0008] 今天,血管生成和用細胞治療的受損屯、臟的再增殖W及特定的藥物和再同步化治 療能夠減緩運種現(xiàn)象的進展,但預(yù)防它的發(fā)生對于屯、臟醫(yī)學(xué)仍然是有疑問的挑戰(zhàn)。因此,需 要預(yù)防有害的左屯、室重構(gòu)的新的治療策略。
      [0009] 發(fā)巧簡沐
      [0010] 本發(fā)明設(shè)及通過施用通過調(diào)節(jié)microRNA的活性或表達來逆轉(zhuǎn)或預(yù)防屯、室重構(gòu) 的組合物治療屯、臟疾病,優(yōu)選缺血性疾病。更具體地,本發(fā)明提供包含設(shè)及血管生成的 microRNA的抑制劑的組合物,所述抑制劑優(yōu)選包含于能夠?qū)⑺鲆种苿┚植酷尫胖寥毖?組織的新的遞送介質(zhì)中。此外,本發(fā)明提供逆轉(zhuǎn)或預(yù)防屯、室重構(gòu)的方法和用于所述方法的 試劑盒。
      [0011] 本發(fā)明設(shè)及一種組合物,其包含有效量的至少一種設(shè)及血管生成的miRNA或其前 體的抑制劑,其中將所述抑制劑微包封成聚合的生物可降解且生物相容的微球。
      [0012]在上述組合物的一些實施方案中,所述miRNA選自包含miR-92 (包括miR-92a-l、 miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、 miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-l和miR-24-2)、 miR-483、miR-:M(包括miR-:Ma、miR-34b和miR-:Mc)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、 miR-15 (包括miR-15a和miR-15b)的家族。
      [0013] 在上述組合物的一些實施方案中,所述miRNA的抑制劑是長度為8-49個核巧酸的 具有祀向所述miRNA或其前體的序列的寡核巧酸。在某些實施方案中,所述寡核巧酸是與 所述祀miRNA或其前體至少部分互補的反義寡核巧酸。所述反義寡核巧酸選自核糖核巧 酸、脫氧核糖核巧酸、小RNA、antagomir、LNA、CDNA、PNA、嗎嘟代寡核巧酸或它們的組合。
      [0014] 在上述組合物的一些實施方案中,所述miRNA的抑制劑由antagomir組成,優(yōu)選由 包含核巧酸序列的antagomir組成,所述核巧酸序列包含至少16個與選自本文所述的SEQ ID NO :1-58的序列的核巧酸互補的連續(xù)核巧酸。
      [001引在上述組合物的一些實施方案中,所述miRNA的抑制劑由包含序列SEQIDNO:59 或60和其除堿基替換之外的修飾,及其片段的antagomir組成,所述片段由SEQIDNO:59 或60的至少8個連續(xù)核巧酸的子序列組成。
      [0016] 在上述組合物的一些實施方案中,所述微球的直徑不超過25ym,包括直徑為 5-20ym,優(yōu)選5-15ym的微球。
      [0017] 在上述組合物的一些實施方案中,所述微球由聚-d,l-丙交醋(PLA)組成的聚合 物制成,所述聚合物任選地與一種或多種其他聚合物混合。
      [0018] 本發(fā)明還設(shè)及逆轉(zhuǎn)或預(yù)防需要其的受試者屯、室重構(gòu)的方法,包括向所述受試者施 用有效量的上述組合物。
      [0019] 本發(fā)明還設(shè)及生物可降解且生物相容的微球群體用于治療或預(yù)防屯、肌梗死的用 途,其中所述微球:
      [0020] -平均直徑為 5-20Jim,優(yōu)選 5-15Jim;
      [0021]-由聚-d,^丙交醋-乙交醋共聚物(PLGA);聚-d,1-丙交醋(PLA)或它們的混 合物制成;
      [002引-包含1% -15%w/w的能夠預(yù)防屯、室重構(gòu)的治療劑;
      [0023] 其中所述治療劑由選自W下的miRNA或其前體的抑制劑組成:miR-92 (包 括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和 miR-16-2)、miR-374 (包括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24 (包括miR-24-1 和 miR-24-2)、miR-483、miR-:M(包括miR-:Ma、miR-34b和miR-:Mc)、miR-20 (包括miR-20a 和miR-20b)、miR-15 (包括miR-15a和miR-15b),優(yōu)選miR-92a。
      【附圖說明】
      [0024]圖I顯示通過掃描電鏡測定的antagomi;r-92a-PLGA微球的形態(tài)。
      [00巧]圖2顯示通過激光散射測定的antagomi;r-92a-PLGA微球的尺寸分布。
      [0026] 圖3顯示通過重復(fù)注射微球直到120mg對血液動力學(xué)和左屯、室收縮性的作用。
      [0027] 圖4顯示通過重復(fù)注射微球直到240mg對血液動力學(xué)和左屯、室收縮性的作用。
      [0028] 圖5顯示單次冠狀動脈內(nèi)注射根據(jù)本發(fā)明的微球的分子作用的研究方案。
      [0029] 圖6顯示本發(fā)明的微球?qū)iR-92a的抑制特異性。
      [0030] 圖7顯示包封的antagomi;r-92a誘導(dǎo)梗死組織中的血管生成。通過將血管總數(shù)除 W總的梗死面積計算梗死區(qū)的血管密度。N= 20.沖<0. 01。
      [003。圖8 :間接測量。AMI后一個月,在用包封的antagomir-92a、安慰劑或鹽水處理的小豬的梗死相關(guān)動脈中測量基礎(chǔ)和最小的微血管阻力指數(shù)。(a)用血壓(mmHg)乘W冠脈流 量(ml/min)來計算基礎(chǔ)微血管阻力指數(shù)(MRI),所述血壓用位于頂端LAD(Pd)的壓力線測 量,和所述冠脈流量用位于LAD遠段的感應(yīng)器定量。用在最大充血測量的相同參數(shù)計算最 小微血管阻力指數(shù)(MRIhyp),所述最大充血通過向股靜脈12F銷靜脈輸注140mg/min的腺巧 來實現(xiàn)。n=12*p<0. 01**p=0. 05?;乃绤^(qū)中血管總數(shù)和MRI之間的關(guān)系。R2 0. 41,p =0. 02,n=12。(C)壞死區(qū)中血管總數(shù)和最小MRI之間的關(guān)系。R2 0. 27,P=0. 08,n= 12。
      [0032] 圖9:直接測量。AMI后一個月,在用包封的antagomir-92a處理和不處理的小豬 的梗死相關(guān)動脈中測量基線和實際微循環(huán)阻力。(a)用血壓(mmHg)除W冠脈流量(ml/min) 來計算基線微循環(huán)阻力(基線MR),所述血壓用位于頂端LAD(Pd)的壓力線測量,和所述冠 脈血流量用位于LAD遠段的感應(yīng)器定量。處理組的基線MR顯著低于對照(7. 47 + 1. 33VS 19. 62 + 2. 98,P= 0.005)。n= 13。用在最大充血測量的相同參數(shù)計算實際微循環(huán)阻力 (TMROiyp)),所述最大充血通過向股靜脈12F銷靜脈輸注140mg/min的腺巧來實現(xiàn)。在處 理組中觀察到顯著低于對照的TMR化yp) (5. 0 + 1. 15vs14. 49 + 2. 4,P= 0. 006)。n= 13。 化)所有壞死區(qū)中血管密度與基線MR之間的關(guān)系。R2= 0. 35,P= 0. 033,n= 13。(C)所 有壞死區(qū)中血管密度與TMRQiyp)之間的關(guān)系。R2= 0. 31,P= 0. 047,n= 13。
      [0033] 圖10 :AMI后一個月,用對分配處理盲法的超聲屯、動圖評估隔頂運動障礙 (S巧toapical diskynesia)的存在。顯示了處理和未處理動物中患有隔頂運動障礙動物的 百分比(83. 3%VS16. 7%,P= 0. 0:3)。n= 20。
      [0034] 圖11:體外評估包封的antagomir92a和未包封的antagomir92a對miR92a表 達的作用。
      [0035] 圖12:包封的antagomir17和20a對它們各自miRNA的作用。
      [0036] 發(fā)巧詳沐
      [0037]W下給出由本發(fā)明涵蓋的所有實施方案的描述相關(guān)的一些定義。
      [003引MicroRNA(MiR)是作為生物過程關(guān)鍵調(diào)節(jié)器的小的非編碼RNA。
      [0039] "MicroRNA"、"miRNA"或"miR"是指長度為約18至約25個核巧酸的非編碼RNA。 運些miR可W來自多種來源,包括:編碼miRNA的單個基因,來自蛋白編碼基因的內(nèi)含子,或 來自通常編碼多個密切相關(guān)的microRNA的多順反子的轉(zhuǎn)錄物。
      [0040] 目前的知識顯示,miRNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII) 轉(zhuǎn)錄,且來自一般為幾千個堿基長的稱為初級miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)的初始轉(zhuǎn)錄 物。pri-miRNA在細胞核中被RNase化OSha加工成約70-100個核巧酸的發(fā)夾型前 體(pre-miRNA)。被運輸?shù)郊毎|(zhì)后,發(fā)夾pre-miRNA進一步被Dicer加工W產(chǎn)生雙鏈 microRNA;然后被稱為成熟microRNA的其中一條鏈(有時兩條鏈均可使用)被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物巧ISC),其中它與它的祀mRNA通過堿基對互補相關(guān)聯(lián)。在相對罕見情 況下,即當HiiRNA堿基對與信使RNA(mRNA)祀標完全配對時,它促使mRNA降解。更普遍的, microRNA與祀mRNA形成不完美的異源雙鏈體,影響mRNA的穩(wěn)定性或抑制mRNA的翻譯。
      [00川"莖環(huán)序列"是指具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)且包含成熟miRNA序列的RNA。pre-miRNA序列和 莖環(huán)序列可W重疊。莖環(huán)序列的實例可W在名為miRBase的microRNA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)。
      [0042] "microRNA前體"是指來源于基因組DNA且包含含有一個或多個microRNA序列的 非編碼結(jié)構(gòu)化RNA的轉(zhuǎn)錄物。例如,在某些實施方案中,microRNA前體是pre-miRNA。在某 些實施方案中,microRNA前體是pri-miRNA。
      [0043]W下說明書將遵循標準命名系統(tǒng),其中沒有大寫的"mir-X"是指pre-miRNA,而大 寫的"miR-X"是指成熟形式。當兩個成熟microRNA來自相同pre-miRNA的不同臂,它們分 別被加W后綴-化或-5p。當相對表達水平已知時,名稱后面的星號表示microRNA相對于 發(fā)夾另一條臂的microRNAW低水平表達。
      [0044] 在W下說明書中,除非另有說明,表述miR-X(如果有的話)用來指包括-化和-5p 兩種形式的成熟miRNA。
      [0045] 為了避免疑問,在本說明書中,表述mic;roRNA、miRNA和MiR是指相同產(chǎn)物。
      [0046] 因此,在本發(fā)明上下文中,目的是用特別關(guān)注的設(shè)及血管生成的microRNA調(diào)控血 管生成或血管生成過程。因此,本發(fā)明的目的是調(diào)控屬于設(shè)及血管生成調(diào)控的microRNA家 族的至少一種microRNA。
      [0047] 表述"microRNA家族"意欲是指具有由調(diào)控血管生成或血管生成過程組成的相關(guān) 功能的一組microRNA。更具體地且非限制性地,所述microRNA選自顯示出抗血管生成活性 的microRNA。
      [0048] 更具體地,且非限制性地,運種microRNA選自miR-92 (包括miR-92a-l、miR-92a-2 和miR-92b)、miR-17、miR-503、miR-16(包括miR-16-l和miR-16-2)、miR-374(包 括miR-374a、miR-374b和miR-374c)、miR-24(包括miR-24-1 和miR-24-2)、miR-483、 miR-:M(包括miR-:Ma、miR-34b和miR-:Mc)、miR-20 (包括miR-20a和miR-20b)、miR-15 (包 括miR-15a和miR-15b),或其前體。對血管生成具有調(diào)控性質(zhì),優(yōu)選括抗性的任何miRNA應(yīng) 當被認為是該microRNA家族的一部分,運對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
      [004引為了避免疑問,除非另有說明,W下說明書中的表述microRNA將是指已經(jīng)從它的 前體切割的成熟或經(jīng)加工的RNA。對于非成熟形式,將使用表述"前體"或"microRNA前體"。
      [0050] 下表1將本說明書涵蓋的microRNA前體的不同序列進行了重新分組。
      [0051]
      [0053] 表I
      [0054] 對于各個microRNA,下表2顯示microRNA的序列和進入相應(yīng)前體序列的相應(yīng)殘基 (參見表1)。
      [00 巧]

      [0057]表 2
      [005引除非另有說明,本申請中所指的前體和microRNA序列是人序列。然而,在某些情 況下,microRNA人序列與來自其他物種的microRNA序列同源。
      [0059] 作為一個實例可W提及,人miR-92a與來自其他物種的miR同源。更具體地, 人miR-92a與來自血e(D;rosophilamelanogaster,黑腹果蛹)、mmu(Musmus州lus,小家 鼠)、rno(Rattusnorvegicus,褐家鼠)、dps值rosophilapseudoobscura,擬暗果蟲單)、 aga(Anophelesgambiae,岡t:t亞按蚊)、dre值aniorerio,斑馬魚)、mml(Macacamulatta, 雜猴)、xtr(Xenopustropicalis,熱帶爪贍)、ame(Apismellifera,意大利蜜蜂)、 odi((Mkopleuradioica,異體住囊蟲)、cin(Cionaintestinalis,玻璃海銷)、csa(Ciona savign}d,薩氏海銷)、cfa(Canisfamiliaris,家犬)和豬或ssc(Susscrofa,野豬)的 miR同源。
      [0060] 根據(jù)其公知常識,本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易發(fā)現(xiàn)其他人microRNA序列和來自其他 物種的microRNA序列之間的同源性。
      [0061] 本文所述的成熟microRNA的核酸序列W及它們相應(yīng)的莖環(huán)序列是在在線可檢索 的microRNA序列和注釋的數(shù)據(jù)庫miRBase中發(fā)現(xiàn)的序列。miRBase序列數(shù)據(jù)庫的進入代表 預(yù)測的microRNA轉(zhuǎn)錄物的發(fā)夾部分(莖環(huán)),W及成熟microRNA序列的定位和序列信息。 數(shù)據(jù)庫中的microRNA莖環(huán)序列不是嚴格的前體miRNA (pre-miRNA),而在某些情況下可W 包括pre-imRNA和來自假定初級轉(zhuǎn)錄物的側(cè)翼序列。
      [0062] 因此,本發(fā)明的目的是提供用于治療或預(yù)防AMI后屯、室重構(gòu)的組合物,所述組 合物包含設(shè)及控制血管生成
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