一種天然產(chǎn)物及用其制備高細胞毒活性cik細胞的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞免疫領域，涉及一種新的化合物在細胞免疫領域的應用，具體涉 及一種檸檬苦素類化合物以及利用該化合物制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法。
【背景技術】
[0002] 構(gòu)樹Broussonetiapapyrifera(L. )Vent.為?？茦?gòu)樹屬植物，分布于中國黃河、 長江和珠江流域，日本、越南、印度等國亦有分布，資源十分豐富。構(gòu)樹的根、葉、果實和樹皮 在中醫(yī)里皆有使用。構(gòu)樹皮能利尿消腫，祛風濕，還可以用于治療神經(jīng)性皮炎及癬癥；樹液 可以利水解毒，治水腫癬疾和蛇、蟲、蜂、蝎、狗咬；構(gòu)樹葉具有清熱涼血、利濕和殺蟲作用， 可用于鼻衄，腸炎，痢疾。構(gòu)樹果實也是中東地區(qū)重要的民間藥材。
[0003] 構(gòu)樹在我國分布廣泛，是一種藥用價值很高的植物，其葉、樹皮、根皮和果實在臨 床均有實際應用價值。構(gòu)樹的化學成分復雜，國內(nèi)外研究者主要關注的化學成分包括黃酮 類、木脂素類和萜類。其中萜類又以二萜研究較多。二萜廣泛分布于植物界，植物分泌的乳 汁、樹脂等均以二萜類衍生物為主，尤以松柏科植物最為普遍，是一類由4個異戊二烯單位 構(gòu)成、含20個碳原子的化合物類群。結(jié)構(gòu)顯示多樣性，主要類型有貝殼杉烷、克羅烷、松香 烷、烏頭烷等。許多二萜的含氧衍生物具有多方面的生物活性，如紫杉醇、穿心蓮內(nèi)酯、關附 甲素、雷公藤內(nèi)酯、甜菊苷等都具有較強的生物活性。
[0004] 免疫治療作為腫瘤綜合治療的第四種模式，越來越受到重視。腫瘤免疫治療主要 包括腫瘤疫苗治療、細胞因子治療、過繼性細胞免疫治療及單克隆抗體免疫治療等。腫瘤 疫苗是利用腫瘤細胞或腫瘤抗原物質(zhì)誘導機體的特異性細胞免疫和體液免疫反應，增強機 體的抗癌能力，阻止腫瘤的生長、擴散和復發(fā)。用于抗腫瘤研究的細胞因子主要有干擾素 類、白細胞介素類、集落刺激因子類等，其中以IFN-α、IL-2、粒-巨噬細胞集落刺激因子為 多。過繼性細胞免疫包括淋巴細胞因子活化的殺傷細胞、自然殺傷細胞、腫瘤浸潤淋巴細 胞、DC-CIK等。單克隆抗體免疫療法的現(xiàn)有研究結(jié)果表明，腫瘤分子靶向治療具有較好的 安全性和有效性，如小分子表皮生長因子受體（EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑、抗EGFR單克隆 抗體、抗血管內(nèi)皮生長因子單克隆抗體以及其他分子靶向治療藥物，已在臨床中取得較好 的療效。
[0005]目前用于腫瘤細胞免疫治療的免疫活性細胞主要有腫瘤浸潤性淋巴細胞（TIL)、 樹突狀細胞（DC)以及細胞因子誘導的殺傷細胞（CIK)等。CIK細胞是一種殺傷力強的免疫 活性細胞，其主要效應細胞的表面標志為CD3+CD56+，與其他過繼性免疫治療細胞相比，具有 增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣等優(yōu)點。但是，腫瘤病人免疫功能受損，免疫細胞功能減 弱，因此，來源于腫瘤病人外周血制備的CIK細胞殺傷腫瘤能力低下，影響CIK細胞療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎的化合物以及利用該該化合物制備高細胞 毒活性的CIK細胞的方法，獲得的CIK細胞具有很強的增殖力，⑶3+、⑶8+和⑶3 +⑶56+細胞 的比例高，并且對腫瘤治療效果優(yōu)異。
[0007] 上述目的是通過如下技術方案實現(xiàn)的：
[0008] 具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0009]
[0010] 所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將構(gòu)樹的干燥根粉碎， 用75~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽 和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟（a) 中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫10個柱體積，再用75%乙醇 洗脫8個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟（b)中 75 %乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、55:1、25:1、8:1和2:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用 體積比為12:1、8:1和4:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟（d)中組分 2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為65%的甲醇水溶液等度洗脫， 收集9~10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物（I)。
[0011] -種利用所述的化合物（I)制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法，包括如下步 驟：（1)取患者外周血，收集外周血的單個核細胞部分；（2)將步驟（1)收集的外周血的單 個核細胞部分離心，棄去上清液，獲得單個核細胞；（3)取單個核細胞按照1X106/mL細胞， 加入含500~2000IU/mLy干擾素和80~120ng/mL化合物（I)的完全培養(yǎng)基，開始誘 導培養(yǎng)；其中，完全培養(yǎng)基，包括含體積百分比為10%FBS的RPMI1640細胞培養(yǎng)液；（4) 步驟（3)的細胞培養(yǎng)20~28小時后，加入50~1000ng/mL抗人⑶3單克隆抗體和500~ 2000IU/mL重組人IL-2,繼續(xù)誘導培養(yǎng)，其中，每隔2~3天傳代培養(yǎng)一次，整個誘導培養(yǎng)的 時間為13~21天，獲得CIK細胞。
[0012] 進一步地，所述的制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法步驟（1)中所述收集外 周血的單個核細胞部分的方法為：(a)患者外周血中，加入1~1. 5倍體積的不含血清的 細胞培養(yǎng)液或pH7. 2PBS緩沖液稀釋，充分混勻；其中，細胞培養(yǎng)液包括：RPMI1640培養(yǎng) 液和頂DM培養(yǎng)液；(b)將步驟（a)獲得的血液稀釋液加入到淋巴細胞分離液的界面上； (c) 1500~2500轉(zhuǎn)/分鐘，離心15~20分鐘，收集中間層，獲得單個核細胞。
[0013] 進一步地，所述的制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法步驟（1)中所述收集外周 血的單個核細胞部分的方法為：患者經(jīng)采用血細胞分離機上的淋巴細胞采集程序，單采集 患者的外周血單個核細胞。
[0014] 進一步地，所述的制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法步驟（2)中，離心的轉(zhuǎn)速為 1000~1500轉(zhuǎn)/分鐘，離心的時間為7~10分鐘。
[0015] 進一步地，所述的制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法步驟（4)所述繼續(xù)誘導培 養(yǎng)，每2~3天用含500~2000IU/mL重組人IL-2的完全培養(yǎng)基或含500~2000IU/mL重 組人IL-2和100~500IU/mL重組人IL-1的完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)。
[0016] 所述的制備高細胞毒活性的CIK細胞的方法制備的CIK細胞。
[0017] 所述化合物（I)在制備高細胞毒活性的CIK細胞中的應用。
[0018] 所述CIK細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。
[0019] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明提供了一種檸檬苦素類新化合物，利用該化合物可以 獲得高純度、高增殖力和高細胞毒活性的CIK細胞，可用于腫瘤的細胞免疫治療。
【附圖說明】
[0020] 圖1為化合物（I)結(jié)構(gòu)式；
[0021] 圖2為化合物（I)理論E⑶值與實驗E⑶值比較；
[0022] 圖3為外周血單個核細胞誘導制備的CIK細胞生長曲線圖；
[0023]圖4為外周血單個核細胞誘導制備的CIK細胞的殺傷腫瘤細胞活性圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容。以下實施例中，所用的原料或 試劑除特別說明外，均為市售可得。所述患者指需要進行CIK細胞免疫治療的患者，如癌癥 患者。另外，以下實施例中，涉及的完全培養(yǎng)基為含10% (體積百分比）FBS的RPMI1640 培養(yǎng)液；冷凍保護劑是含10% (體積百分比）DMS0的培養(yǎng)基，其中，該培養(yǎng)基是由70% (體 積百分比）RPMI1640培養(yǎng)液和20 % (體積百分比）FBS(胎牛血清）所構(gòu)成。
[0025] 實施例1:化合物（I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0026] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0027] 制備方法：（a)將構(gòu)樹的干燥根（10kg)粉碎，用80%乙醇熱回流提取（25LX3 次），合并提取液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次）和 水飽和的正丁醇（3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物（386g)和正丁 醇萃取物；(b)步驟（a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用5%乙醇洗脫10個 柱體積，再用75 %乙醇洗脫8個柱體積，收集75 %乙醇洗脫液，減壓濃縮得75 %乙醇洗脫物 浸膏（155g) ;(c)步驟（b)中75%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(8 個柱體積）、55:1 (8個柱體積）、25:1 (8個柱體積）、8:1 (10個柱體積）和2:1 (5個柱體積） 的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟（c)中組分4 (41g)用正相