一種產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]對(duì)硝基苯胺被認(rèn)為是一種典型的劇毒污染物，在其合成和使用過(guò)程中都會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。尤其對(duì)水體及土壤有很大的破壞作用，從而影響其中的生物群落。因此，目前大部分的研究旨在于硝基化合物的降解和其中硝基的還原。然而，對(duì)二硝基苯也是一種重要的工業(yè)化學(xué)品，在自然界存在相對(duì)較少，主要是通過(guò)人類活動(dòng)而引入到環(huán)境中。這一重要的工業(yè)化學(xué)品廣泛運(yùn)用于許多產(chǎn)品的合成中，具有重要的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。目前工業(yè)應(yīng)用上大都采用化學(xué)法合成硝基化合物，合成過(guò)程很難控制，成本較高，污染嚴(yán)重，危險(xiǎn)系數(shù)高。與化學(xué)法相比，生物酶法催化氧化對(duì)硝基苯胺的氨基變?yōu)橄趸?，無(wú)需加入強(qiáng)酸作為催化劑及引發(fā)劑，催化氧化整個(gè)反應(yīng)過(guò)程，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，降低了生產(chǎn)成本，使得整個(gè)合成過(guò)程效率高，安全綠色，簡(jiǎn)單可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，該枯草芽孢桿菌培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生加氧酶，能夠有效地將氨基轉(zhuǎn)化為硝基，改善環(huán)境，耗費(fèi)資源少。
[0005]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
一種產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌，實(shí)現(xiàn)氨基氧化為硝基的枯草芽孢桿菌(也〃7^?sub tilis ) ALOOI,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為武漢市武漢大學(xué)，保藏日期為2015年9月11日，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2015524。
[0006]上述產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌菌落表面粗糙不透明，污白色，邊緣不整，需氧生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度28~39°C，最適溫度為30°C，在pH 5.0-10.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，不產(chǎn)色素，菌株形態(tài)長(zhǎng)桿狀，革蘭氏陽(yáng)性。
[0007]上述產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌在實(shí)現(xiàn)氨基氧化為硝基的應(yīng)用。
[0008]上述產(chǎn)加氧酶的枯草芽孢桿菌在實(shí)現(xiàn)氨基氧化為硝基的應(yīng)用，包括以下步驟: 步驟I，將枯草芽孢桿菌(Bacillus sub tilis) ALOO拖種至在產(chǎn)酶培養(yǎng)基，在溫度
20-370C，轉(zhuǎn)速200 rpm下發(fā)酵60~96h，離心取上清得粗酶；
步驟2，往對(duì)硝基苯胺中加入粗酶，氧化反應(yīng)得對(duì)二硝基苯。
[0009]作為改進(jìn)的是，步驟I中所述的產(chǎn)酶培養(yǎng)基組分為葡萄糖10~40g/L，蛋白胨10~20g/L，玉米漿10~20g/L，磷酸氫二鉀0.7g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，硫酸鎂0.5g/L，NaCl 5g/L,初始pH 6-8 ;發(fā)酵溫度30°C，通氣量為0.5?Ivvm0
[0010]作為改進(jìn)的是，步驟2中氧化反應(yīng)溫度20~50°C。
[0011]作為進(jìn)一步改進(jìn)的是，步驟2中氧化反應(yīng)溫度為40°C。
[0012]作為改進(jìn)的是，步驟2中氧化反應(yīng)pH為6.0~8.0。
[0013]作為進(jìn)一步改進(jìn)的是，步驟2中氧化反應(yīng)pH為7.0-7.5。
[0014]作為改進(jìn)的是，步驟2中氧化反應(yīng)為向氧化體系中加入Na+、Fe2+或Mg'
[0015]作為進(jìn)一步改進(jìn)的是，步驟2中氧化反應(yīng)為向氧化體系中加入終濃度為10mmol/Lp02+
丄O
[0016]
有意效果
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)勢(shì):
與化學(xué)法相比，反應(yīng)溫和，過(guò)程易操控，常溫下的高反應(yīng)速率、優(yōu)異的化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和立體選擇性、等特點(diǎn)，具有能耗低、物耗少，對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
[0017]
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為枯草芽孢桿菌(Bacillus sub iihi)說(shuō)伙V為菌革蘭氏染色形態(tài)，其中菌體呈紫色。
[0019]圖2為枯草芽抱桿菌說(shuō)洲/菌落形態(tài)圖。
[0020]圖3 為枯草芽抱桿菌(ifeciWiA? sub tilis) ALOOl 16s 對(duì)比圖。
[0021]圖4為枯草芽孢桿菌subtil is) jZO似氧化對(duì)硝基苯胺生成對(duì)二硝基苯的氣相色譜檢測(cè)(安捷倫GC-7890B)圖譜，其中，5.157的峰為對(duì)硝基苯胺的響應(yīng)峰。
[0022]圖5為枯草芽孢桿菌{Bacillus sub tilis) 氧化反應(yīng)中pH對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。
[0023]圖6為枯草芽孢桿菌subtil is) jZO似氧化反應(yīng)中溫度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。
[0024]
【具體實(shí)施方式】
[0025]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1枯草芽孢桿菌(ifeciWiAS篩選與鑒定 (一)樣品米集
從臺(tái)州獲得海水樣共30份，及時(shí)存于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027](二)富集培養(yǎng)
取50ml腦心浸液肉湯培養(yǎng)基裝于500ml三角瓶中，滅菌后接入Iml待篩樣品，37°C，200rpm條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24h，得到富集培養(yǎng)液。
[0028](三)平板篩選
用無(wú)菌單層濾紙將富集培養(yǎng)液過(guò)濾，梯度稀釋10-6到10-10，吸取0.2ml稀釋涂布于篩選培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)5d，將所有長(zhǎng)出的菌落斜面保藏。
[0029](四)搖瓶篩選將平板上保藏的菌接入液體篩選培養(yǎng)基中，培養(yǎng)5d，測(cè)底物與產(chǎn)物的含量，并鑒定是否能使氨基氧化為硝基。
[0030]篩選培養(yǎng)基:lg/L的對(duì)硝基苯胺、5g/L葡萄糖、5g/L酵母膏、5g/L玉米漿、磷酸氫二鉀0.7g/L，磷酸二氫鉀0.3g/L，硫酸鎂0.5g/L。
[0031]該菌的形態(tài)、生理生化特征如下:
菌落形態(tài)及顏色:邊緣不整，灰白色。菌體形態(tài):長(zhǎng)桿狀。革蘭氏染色:陽(yáng)性。需氧方式:好氧生長(zhǎng)。生長(zhǎng)溫度:28-39°C。生長(zhǎng)pH:5.0-10.0，耐鹽生長(zhǎng)范圍0%_10% NaCl。
[0032]菌株鑒定:提取該基因組后設(shè)計(jì)引物對(duì)其16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GeneBank中的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)該菌與其同源性最高的模式菌株均屬Bacillus菌屬。判定該菌為芽孢桿菌綱、芽孢桿菌目、芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，命名為Wa c i W μsubtilis ALOOl 0
[0033]
實(shí)施例2
枯草芽孢桿菌sub tilis) 在發(fā)酵產(chǎn)加氧酶及轉(zhuǎn)化對(duì)硝基苯胺的應(yīng)用種子培養(yǎng)基:葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏10 g/L，磷酸氫二鉀0.7g/L，磷酸二氫鉀 0.3g/L,硫酸鎂 0.5g/L, NaCl 5g/L,培養(yǎng)溫度 37°C，200 rpm ；