茶葉葉圍優(yōu)勢菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，設(shè)計(jì)茶葉葉圍微生物開發(fā)及其在農(nóng)藥殘留降解降污中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]葉圍微生物以“聯(lián)合”或者“粘附”方式附生在植物表面，參與植物生理活動(dòng)，如光合作用的Ca2+信號傳遞、電子交換等物質(zhì)和能量交換。在長期的進(jìn)化過程中，與植物形成互助進(jìn)化機(jī)制，大多具有運(yùn)動(dòng)性和趨化性，會(huì)對葉表面化學(xué)影響做出正反應(yīng)，反過來，葉表面的化學(xué)組成也會(huì)影響葉面附著微生物的結(jié)構(gòu)與特性。農(nóng)藥作為植物生長環(huán)境過程中一個(gè)重要的因素，在很大程度上影響植物葉面微生態(tài)環(huán)境也改變了葉表面附著物的化學(xué)組成結(jié)構(gòu)，進(jìn)而誘導(dǎo)附著微生物功能特性的協(xié)同進(jìn)化。
[0003]茶是多年生灌木，整個(gè)生活史長達(dá)幾十年，由于病蟲害的發(fā)生以及茶葉自身強(qiáng)吸附性，使得農(nóng)藥施用容易導(dǎo)致茶葉農(nóng)藥殘留超標(biāo)，因此尋找降解茶葉農(nóng)殘超標(biāo)的方法對于提高茶葉安全質(zhì)量意義重大。而微生物通過分泌某些代謝物或者自身酶系統(tǒng)對外源農(nóng)藥進(jìn)行解毒、氧化、還原等方式實(shí)現(xiàn)生物降解，無二次污染，環(huán)保，安全。因此微生物降解是治理農(nóng)藥殘留超標(biāo)的安全綠色方法。從茶葉葉圍微生物篩選和分離對農(nóng)藥殘留具有降解的作用的降解菌，可以實(shí)現(xiàn)原位降解，避免出現(xiàn)環(huán)境不兼容問題，也保證環(huán)境安全問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一株高效、定植能力強(qiáng)的具有吡蟲啉原位生物修復(fù)作用的不動(dòng)桿菌及其應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種茶葉葉圍優(yōu)勢菌，經(jīng)鑒定為不動(dòng)桿菌(Wcifle1Aactersp)，編號BCL-1，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2015年9月8號，保藏編號為:CGMCCN0.11343;菌株16 S rDNA的Genbank的登錄號為KT370860，不動(dòng)桿菌sp) BCL-1為革蘭氏陰性，菌株桿狀，大小約為:1.3X2.7 μπι，氧化酶、檸檬酸鹽利用測定為陽性；淀粉水解、明膠液化、硫化氫、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖發(fā)酵測定為陰性。
[0006]—株茶葉葉圍優(yōu)勢菌的應(yīng)用，所述不動(dòng)桿菌(Wcifle1Aacter sp) BCL-1能以P比蟲啉為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長，用于原位降解茶葉上殘留的吡蟲啉。
[0007]所述的原位降解為直接可以定植于茶葉鮮葉并進(jìn)行茶葉鮮葉吡蟲啉殘留的生物降解。
[0008]茶葉葉圍優(yōu)勢菌Acinetobacter sp對R比蟲啉的降解，通過液態(tài)形式發(fā)酵液進(jìn)行，所述降解在28-35 °C、pH6.5-8.下進(jìn)行；優(yōu)選的，所述降解在30 °C、pH=7.5下進(jìn)行。
[0009]茶葉葉圍優(yōu)勢菌Wcifle1Aacter sp可原位凈化茶葉鮮葉啦蟲啉，實(shí)現(xiàn)茶葉鮮葉P比蟲啉殘留中的原位降解應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明的不動(dòng)桿菌BCL-1是常見細(xì)菌，經(jīng)檢索專利和其他相關(guān)文獻(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)其是茶葉葉圍優(yōu)勢微生物組成結(jié)構(gòu)，也未發(fā)現(xiàn)能夠降解吡蟲啉的不動(dòng)桿菌屬菌種，且該菌種能夠在低濃度下對吡蟲啉進(jìn)行降解，在茶葉鮮葉上具有良好的定殖能力和對茶葉鮮葉卩比蟲啉的降解效能高。該菌從茶葉葉圍中分離到，且可以在3d內(nèi)降解100mg/l的吡蟲啉達(dá)到93.2%。用途為:該菌用于茶葉鮮葉中吡蟲啉殘留的原位生物降解，還可用于受吡蟲啉污染的水體、土壤和農(nóng)產(chǎn)品的生物凈化。
【附圖說明】
[0011]圖1為本發(fā)明中茶葉葉圍優(yōu)勢菌Acinetobacter sp的透射電鏡照片；
圖2為吡蟲啉測定結(jié)果圖；
圖3為本發(fā)明中茶葉葉圍優(yōu)勢菌Acinetobacter sp對P比蟲啉的降解效果圖(圖中Retat1n time表示物質(zhì)分離的保留時(shí)間；Intensity表示物質(zhì)的豐度)；
圖4為pH對Acinetobacter sp降解P比蟲啉效果的影響；
圖5為溫度對Acinetobacter sp降解啦蟲啉效果的影響；
圖6為底物濃度對Acinetobacter sp降解啦蟲啉效果的影響；
圖7為Acinetobacter sp對茶葉鮮葉啦蟲啉殘留的降解能力評估。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。
[0013]實(shí)施例1:茶葉葉圍優(yōu)勢菌的分離及吡蟲啉降解菌BCL-1的馴化、篩選。
[0014]茶葉葉圍優(yōu)勢菌的分離及吡蟲啉降解菌的馴化和篩選，具體步驟如下:
茶葉葉圍優(yōu)勢菌的分離:采用五點(diǎn)取樣法，用無菌紙袋及無菌剪刀采集茶枝第一、二、三、四葉、老枝著生葉各50片，充分混勻，然后隨機(jī)取20片，用直徑1厘米的無菌打孔器取葉片組織塊，隨機(jī)取葉片組織40塊，放入100毫升無菌水中充分振蕩30min，制成含菌液。取1毫升含菌液體加到無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，將已融化、溫度降至40-45°C的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基導(dǎo)入有含有菌液體培養(yǎng)皿中，迅速混勻，待凝固后置于恒溫培養(yǎng)箱中，30°C，培養(yǎng)2天。
[0015]所述牛肉膏蛋白胨(NA)培養(yǎng)基為(1L):牛肉膏10.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖5.0 g，ρΗ7.2ο
[0016]吡蟲啉降解菌的馴化培養(yǎng):將ΝΑ培養(yǎng)基上分離到的菌株，進(jìn)行純化，并接種到ΝΑ液體培養(yǎng)液中制成菌懸液。取10ml菌懸液接入到50ml的吡蟲啉無機(jī)鹽培養(yǎng)基中(吡蟲啉濃度為50mg/l)，于30°C、180r/min搖床上震蕩培養(yǎng)7d ;每隔24小時(shí)進(jìn)行菌株生長量和吡蟲啉濃度的檢測。
[0017]所述無機(jī)鹽培養(yǎng)基(1L)為:每升無機(jī)鹽培養(yǎng)基含磷酸氫二鈉1.5g，磷酸二氫鉀1.5g，硝酸錢lg，硫酸鎂0.2g,氯化I丐0.0lg，硫酸亞鐵0.0Olg，酵母提取物0.05g。
[0018]所述菌株生長量測定:菌株生長量的測定以菌體濕重作為指標(biāo)，取5ml的培養(yǎng)液進(jìn)行l(wèi)OOOOrmp離心，稱取菌體濕重。
[0019]所述培養(yǎng)液中吡蟲啉濃度的測定:取10 mL培養(yǎng)液于50 mL帶磨口塞的三角瓶中，加入10 mL 二氯甲烷，蓋上瓶塞，超聲波提取5 min，吸取下層于一新的錐形瓶中，上層清液再加入5 mL 二氯甲烷超聲提取2 min，取下層與第一次下層有機(jī)相合并，轉(zhuǎn)移入一干凈的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，調(diào)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀溫度至40°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干之后，向瓶中加入2 mL色譜級甲烷，旋轉(zhuǎn)搖蕩使瓶壁上殘留農(nóng)藥盡量溶解，過0.45 Mm有機(jī)濾膜，收集溶液于GC小瓶中，經(jīng)高效液相色譜柱分析菌株對吡蟲啉的降解率。高效液相色譜條件:色譜柱:Symmetry C18 (0.5umX4.5 minX250 mm)。檢測器:L_2430檢測器；流動(dòng)相:水/甲醇(1:4，v/v);流速:1mL/min:進(jìn)樣量10 μ L，柱溫30°C，檢測波長270nm。
[0020]相對降解率=(CK含量-降解菌講解后含量)/CK含量X 100%
吡蟲啉降解菌的篩選:菌株BCL-1在吡蟲啉無機(jī)鹽培養(yǎng)基內(nèi)的生長量增長最快，5天內(nèi)達(dá)到0.082mg/ml，及對無機(jī)鹽