體內(nèi)快速分析rna功能元件的系統(tǒng)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種體內(nèi)快速分析RNA功能元件的系 統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 真核生物mRNA的3'UTR(3'Un-TranslatedRegion)上有多種調(diào)控元件，可W 特異的招賽各種miRNA及RNA結(jié)合蛋白，從而能夠調(diào)巧mRNA的降解、翻譯和亞細(xì)胞定位 (Qiatterjeeetal.,BiologyoftheCell, 2009;MayrandBartel,Cell, 2009;Szostak andGebauer. ,briefingsinF^mctionalGenomics, 2012)。真核生物mRNA的 3,UTR- 般都是長長的序列，而那些有功能的調(diào)控元件就隱藏在其中，目前，科學(xué)研究中仍然缺少高 效、便捷分析mRNA3'UTR中的功能性元件的系統(tǒng)。
[0003] 有研究者在人類細(xì)胞中轉(zhuǎn)入一種載體，利用雙向啟動子分別啟動GFP和mCherry 的基因轉(zhuǎn)錄，其中GFP作為內(nèi)參，mCher巧終止密碼子之后與不同序列的3'UTR分別融合而 形成報告基因；然后，通過流式細(xì)胞儀和高通量測序檢測各種短的非編碼RNA對報告基因 RNA穩(wěn)定性或翻譯的影響（(Mkonomouetal.，CellR巧ort，2014)。另外，也有研究者構(gòu)建 了類似的載體，并通過細(xì)胞流式分類（flow巧tometricscxrting)鑒定了一系列影響RNA 翻譯或穩(wěn)定性的順式作用元件狂haoetal.,化1:ureBiotechnology, 2014)。
[0004] 目前并沒有在植物體內(nèi)快速尋找mRNA3'UTR中有功能的順式作用元件的方 法。其次，運(yùn)些順式作用元件通常是需要響應(yīng)外源藥物處理、內(nèi)源信號通路或效應(yīng)蛋白 (effectorprotein)來完成對mRNA的調(diào)控。已報道的系統(tǒng)均通過大規(guī)模的篩選、分析、鑒 定RNA順式作用元件RNA序列，但并未提及能否檢測內(nèi)外源信號或效應(yīng)蛋白對運(yùn)些元件的 調(diào)控作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種體內(nèi)快速分析RNA功能元件的系統(tǒng)，解決現(xiàn)有技術(shù)中無法 在植物體內(nèi)快速尋找mRNA3'UTR中有功能的順式作用元件，W及檢測內(nèi)、外源信號及效應(yīng) 蛋白對順式作用元件的調(diào)控作用的問題。
[0006]本發(fā)明解決技術(shù)問題采用如下技術(shù)方案：一種體內(nèi)快速分析RNA功能元件的系 統(tǒng)，包括雙巧光報告載體p35mG，所述載體包括編碼SEQIDNo. 1的序列。
[0007] 優(yōu)選地，所述雙巧光報告載體p35mG是由下述步驟制得：將PCAMBIA2335載體的 抗性基因ΝΡΤΠ用限制性內(nèi)切酶化〇1切掉，連入mCher巧巧光蛋白基因；在多克隆位點(diǎn)中 化nl和甜al兩個酶切位點(diǎn)間連入GFP巧光蛋白基因，所述mCherry巧光蛋白和所述GFP巧 光蛋白分別由同一個載體上的兩個不同的35S啟動子驅(qū)動。
[0008] 優(yōu)選地，所述雙巧光報告載體p35mG中連入待測基因片段后構(gòu)建成重組報告基因 在植物體中瞬時表達(dá)。
[0009] 優(yōu)選地，還包括效應(yīng)蛋白載體，所述效應(yīng)蛋白載體與重組報告基因在植物體內(nèi)共 表達(dá)。
[0010] 優(yōu)選地，所述效應(yīng)蛋白載體為效應(yīng)蛋白連入任一植物表達(dá)載體。
[0011] 優(yōu)選地，所述重組報告基因和所述效應(yīng)蛋白載體由農(nóng)桿菌介導(dǎo)在煙草葉片中瞬時 表達(dá)。
[0012] 優(yōu)選地，由所述重組報告基因中GFP和mCherry在植物體內(nèi)表達(dá)的巧光強(qiáng)度的比 值鑒定待測基因片段。
[0013] 一種體內(nèi)快速分析RNA功能元件的方法，包括如下步驟：
[0014] (1)構(gòu)建雙巧光報告載體p35mG，所述載體包括編碼SEQIDNo. 1的序列；
[001引 似在所述雙巧光報告載體p35mG中連入待測基因片段，構(gòu)建得到重組報告基因；
[0016] (3)將所述重組報告基因瞬時表達(dá)在植物體中；
[0017] (4)分析所述重組報告基因中GFP和mCherry在植物體內(nèi)表達(dá)的巧光強(qiáng)度，并計算 兩者巧光強(qiáng)度的比值，鑒定待測基因片段。
[0018] 優(yōu)選地，所述方法還包括構(gòu)建效應(yīng)蛋白載體，將效應(yīng)蛋白連入植物表達(dá)載體后，與 重組報告基因在植物體中共表達(dá)。
[0019] 一種體內(nèi)快速分析RNA功能元件的系統(tǒng)的應(yīng)用，檢測內(nèi)外源信號或效應(yīng)蛋白對體 內(nèi)RNA功能元件的調(diào)控作用。
[0020] 本發(fā)明通過構(gòu)建包括編碼SEQIDNo. 1序列的雙巧光報告載體p35mG，其中包括一 個巧光蛋白mCherry作為內(nèi)參，一個巧光蛋白GFP作為報告基因，連入待測基因片段后構(gòu)建 成重組報告基因，通過分析不同片段對GFP與mCherry巧光強(qiáng)度比值的影響，快速鑒定待測 基因片段RNA中的順式作用元件；并且可W通過施加不同處理或表達(dá)不同的效應(yīng)蛋白來控 制順式作用元件調(diào)控的過程，W此研究植物體內(nèi)效應(yīng)蛋白對RNA的調(diào)控作用。
【附圖說明】
[0021] 圖 1 為PCAMBIA2335 載體圖；
[002引圖2為本發(fā)明快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)的p35mG圖；
[0023]圖3為本發(fā)明快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)的流程示意圖；
[0024] 圖4為本發(fā)明快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)檢測乙締信號介導(dǎo)的3'UTR對 GFP蛋白翻譯的抑制效應(yīng)的示意圖；
[0025] 圖5為本發(fā)明快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)檢測RNA功能元件響應(yīng)ACC并介 導(dǎo)翻譯抑制過程的示意圖；
[0026] 圖6為本發(fā)明快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)鑒定響應(yīng)乙締信號并介導(dǎo)翻譯抑 制的片段的結(jié)果示意圖；
[0027] 圖7為本發(fā)明快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)檢測效應(yīng)蛋白對RNA翻譯抑制作 用的結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述。W下實(shí)施例中使用的 試劑和材料均為市售商品。
[0029] 實(shí)施例1
[0030] 本實(shí)施例提供了一種快速分析體內(nèi)RNA功能元件的系統(tǒng)，對圖1所示的 PCAMBIA2335載體進(jìn)行改造，將其抗性基因ΝΡΤΠ用限制性內(nèi)切酶化〇1切掉，連入mCherry 巧光蛋白基因；在多克隆位點(diǎn)中化nl和Xbal兩個酶切位點(diǎn)間連入GFP巧光蛋白基因，運(yùn)樣 兩個巧光蛋白分別由同一個載體上的兩個不同的35S強(qiáng)啟動子驅(qū)動，就構(gòu)成了一個雙巧光 報告載體，命名為pCAMBIA2335mG，簡稱p35mG，如圖2所示。
[0031] 具體構(gòu)建載體的方法如下：
[0032] 1.引物
[0033]擴(kuò)增mCher巧：
[0034] 正向引物
[0035]tctctcg曰gctttcgc曰g曰tctgtcg曰teg曰CC曰tggtg曰gc曰曰gggcg曰gg曰gg曰t曰曰C曰tggcc曰tc 過tc過過gg過gttc
[0036] 弓I坪勿agcctcgagtcacttgtacagctcgtccatgccgccggtggag
[0037]擴(kuò)增GFP:
[0038]正向引物gtcggtaccatggtgagcaagggcga邑
[0039] 反向引物ttatctagatccggtggatccaagcttc
[0040] 2.PCR體系
[0041]
[0042]PCR程序：94°C 2min
[0043] 94°C15s，58°C 30s，68°Clmin，35 個循環(huán)
[0044] 68°C lOmin
[0045] 10°ClOmin反應(yīng)結(jié)束
[0046] 切膠回收：A巧gen試劑盒
[0047] 3.酶切
[0048]
[004引酶切條件：37°C，2-3小時[0050]酶切產(chǎn)物回收：Axygen試劑盒 [005U 4.連接：
[0052]
[0053] 連接條件：肥B的T4連接酶，室溫（22°C-25°C) 2-3小時
[0054] 5.轉(zhuǎn)化涂板
[0055] 將連接產(chǎn)物全部加入50μΙ感受態(tài)中，42°C熱激1分鐘后加入600uLLB，37度 220巧m搖菌40min，涂板。
[005引6.提質(zhì)粒，采用Axygen試劑盒。
[0057] 7.克隆鑒定
[0058]
[0059] 能切下大小正確的片段的質(zhì)粒送測序，保存測序正確的質(zhì)粒。
[0060] 本實(shí)施例中，將p35mG中的mCherry作為內(nèi)參，GFP后面連入需要鑒定功能的 3'UTR片段生成新的重組報告基因GFP-3'UTR，該重組子的構(gòu)建方法與上述構(gòu)建p35mG載 體的方法類似，具體引物序列依不同目的基因片段而設(shè)計不同序列，如圖3A所示，即為重 組報告基因；效應(yīng)蛋白連入另一個載體中，如圖3B所示，即為效應(yīng)蛋白載體；如圖3C所示， 將構(gòu)建的重組報告基因和效應(yīng)蛋白載體由農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬時表達(dá)在煙草葉片中，有圖3D所 示，重組報告基因中的GFP和mCherry兩種巧光蛋白同時表達(dá)；如圖3E所示，根據(jù)ZEN軟件 分析給出的GFP和mCher巧巧光強(qiáng)度，計算GFP與mCher巧巧光強(qiáng)度的比值，即可衡量不同 3'UTR片段W及效應(yīng)蛋白對GFP報告基因翻譯的影響。
[0061] 農(nóng)桿菌侵染煙草及巧光觀察實(shí)驗(yàn)方法如下：
[0062] 選擇生長一個月左右的煙草。從-80°C冰箱中取出保存的菌液，涂在含有抗生素的 LB培養(yǎng)皿上，3(TC培養(yǎng)過夜。挑取在板上生長的菌落，接入含有抗生素的LB液體培養(yǎng)基 中，30°C，220rpm搖菌過夜，至菌液為橘黃色。按1:500將過夜培養(yǎng)的菌液接入15mL含有抗 生素的LB液體培養(yǎng)基中，30°C，220巧m搖菌過夜，至ODe。。約為1. 5。4000巧m，4°C離屯、15min 收集菌體，用15mL煙草葉片侵染緩沖液重懸。400化pm，4°C離屯、15min收集菌體，用lOmL煙 草葉片侵染緩沖液重懸。再次4000rpm，4°C離屯、15min收集菌體，用lOmL煙草葉片侵染緩 沖液重懸。測重懸后菌體的濃度，將ODe。。調(diào)至0. 5 (若同時注射兩種菌，將0De。。調(diào)至0. 6。 將兩種菌液按1:1的體積比混合），用ImL注射器將菌液注入煙草葉片的下表皮，打滿整片 葉子。22°C培養(yǎng)2-3天后即可觀察巧光。取要觀察的煙草葉片置于載玻片上，加50-lOOuL 蒸饋水并加蓋蓋玻片，置于顯微鏡載物臺，本發(fā)明所用激發(fā)波長為：GFP巧10nM-543nM)、 mCherry巧61nM-633nM)，然后進(jìn)行巧光觀察和拍照。蔡司的ZEN軟件可W自動分析不同通 道的巧光強(qiáng)度。
[0063] 將p35mG空載體瞬時表達(dá)在煙草葉片中，使用低倍物鏡（如5訝觀察煙草葉片并 拍照記錄GFP和mCher巧的巧光。非同一棵煙草、非同一片葉片W及同一葉片的不同位置， 巧光表達(dá)強(qiáng)度可能都不一致，需要選取不同煙草不同葉片的不同位置分別拍照并檢測巧光 強(qiáng)度計算GFP與mCherry的巧光強(qiáng)度比值，具體數(shù)據(jù)結(jié)果見下表1 :
[0064] 表1重組報告基因中GFP與mCherry在煙草葉片中表達(dá)的巧光強(qiáng)度
[0065]
[0066]
[0067] 從W上結(jié)果可W看出，不同的煙草葉片W及不同視野中的巧光強(qiáng)度都不一致，但 是每個視野中GFP巧光增強(qiáng)時，mCherry巧光也會相應(yīng)增強(qiáng)，反之亦然，即GFP與mCherry的 比值基本一致。所W如果在GFP的編碼區(qū)之后接上一段3'UTR序列，能夠?qū)е卤戎底兓?則說明運(yùn)段序列影響了GFP巧光蛋白的表達(dá)。通過施加不同處理或表達(dá)效應(yīng)蛋白來檢測帶 有RNA功能元件的GFP與mChe