通過(guò)將干細(xì)胞移植到膽管壁來(lái)治療胰腺和肝臟病癥的方法
【專利說(shuō)明】通過(guò)將干細(xì)胞移植到膽管壁來(lái)治療膜腺和肝臟病癥的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年3月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/780, 644號(hào)W及2014年3 月12日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)14/207, 191號(hào)的優(yōu)先權(quán)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明大體設(shè)及基于細(xì)胞的療法領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明設(shè)及用于治療膜腺和肝 臟病癥的細(xì)胞療法，特別是干細(xì)胞/祖細(xì)胞療法。所確定的干細(xì)胞群/祖細(xì)胞群可為膽管 樹(shù)干細(xì)胞、肝干細(xì)胞、膜腺干細(xì)胞、定向肝或膜腺祖細(xì)胞、或間充質(zhì)干細(xì)胞。它們也可能是胚 胎干細(xì)胞巧巧或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iP巧的衍生物。本申請(qǐng)要求2013年3月13日提交的 美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/780, 644號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用合并至本文中。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 再生醫(yī)學(xué)已進(jìn)入了一個(gè)新的階段，干細(xì)胞群被移植到患者W恢復(fù)受損的或患病的 組織，例如肝臟和膜腺。由于肝炎病毒、飲酒、飲食和代謝疾病、W及其他原因，肝病可能導(dǎo) 致器官衰竭，并且在世界范圍內(nèi)構(gòu)成了主要的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。類似地，在世界范圍內(nèi)，膜腺疾病 (特別是糖尿?。┦菍?dǎo)致健康問(wèn)題和死亡的主要原因。干細(xì)胞/祖細(xì)胞療法是解決運(yùn)些治 療需要的可能途徑，并且世界范圍內(nèi)臨床項(xiàng)目正不斷增加W進(jìn)一步開(kāi)發(fā)運(yùn)些新型的療法。 雖然許多類型的前體細(xì)胞正用于臨床項(xiàng)目測(cè)試W治療肝臟和膜腺，但短期內(nèi)僅有某些可能 用于臨床項(xiàng)目。
[0006] 干細(xì)胞生物學(xué)概述
[0007] 干細(xì)胞或其子代、定向祖細(xì)胞都能夠持續(xù)繁殖并分化成為特化細(xì)胞。干細(xì)胞的決 定性的定義區(qū)別是其自我更新的能力，即，通過(guò)對(duì)稱或非對(duì)稱細(xì)胞分裂而無(wú)限期地維持具 有相同性質(zhì)的種群。相反，祖細(xì)胞在發(fā)育或再生期間在細(xì)胞群的擴(kuò)增中起到短暫的作用。當(dāng) 祖細(xì)胞的自我更新能力不能被嚴(yán)格確定時(shí)，研究人員有時(shí)使用術(shù)語(yǔ)"干細(xì)胞/祖細(xì)胞"。對(duì) 于設(shè)及使用干細(xì)胞和/或祖細(xì)胞的細(xì)胞療法，也使用運(yùn)個(gè)術(shù)語(yǔ)。
[0008] 在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的第一階段，干細(xì)胞與后期階段的原生殖細(xì)胞一起具有產(chǎn)生 所有體細(xì)胞類型的非凡能力，因此稱為多能的。胚胎肝細(xì)胞巧巧在大量擴(kuò)展成為確定性細(xì) 胞系期間維持多能性。ES細(xì)胞的自我更新潛能顯得幾乎是無(wú)限制的，即使自發(fā)性突變和染 色體重排最終降低了它們的實(shí)用性。通過(guò)導(dǎo)入一小組確定的遺傳因子來(lái)對(duì)成熟體細(xì)胞進(jìn)行 重編程，可產(chǎn)生類似的多能干細(xì)胞，運(yùn)些細(xì)胞被稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS)。
[0009] 間充質(zhì)干細(xì)胞或MSC可來(lái)源于骨髓、脂肪組織、廝帶結(jié)締組織、怖arton氏膠和羊 水，容易在常規(guī)培養(yǎng)條件下在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，可通過(guò)血管通路或通過(guò)移植法來(lái)移植，并且可 譜系限制成任何中胚層結(jié)局（例如骨、軟骨、腫、肌肉）。它們能夠譜系限制成內(nèi)胚層或外胚 層結(jié)局，但效率極低，W至于運(yùn)個(gè)特點(diǎn)對(duì)于臨床項(xiàng)目來(lái)說(shuō)沒(méi)有實(shí)用性。MSC對(duì)于臨床項(xiàng)目的 有用性被證明主要是由于它們生成旁分泌信號(hào)（基質(zhì)和可溶性因子）或由于免疫調(diào)節(jié)機(jī)制 導(dǎo)致的，運(yùn)些發(fā)現(xiàn)使得它們?cè)谑澜绶秶鷥?nèi)應(yīng)用于臨床項(xiàng)目W緩解肝病和膜腺疾?。òㄌ?尿?。?。
[0010]
[0011] 確定性干細(xì)胞，通常稱為"成體干細(xì)胞"，存在于胎兒組織和出生后組織中，但限于 胚層（外胚層、中胚層、內(nèi)胚層）確定的特定譜系。確定性干細(xì)胞（及其子代、定向祖細(xì)胞） 補(bǔ)充因正常更新或損失和疾病而喪失的成熟細(xì)胞。某些成熟細(xì)胞類型（例如血細(xì)胞W及腸 道內(nèi)襯細(xì)胞或皮膚外層內(nèi)襯細(xì)胞）壽命有限，并且必須被快速替換。其他成熟細(xì)胞，例如屯、 肌細(xì)胞和某些神經(jīng)細(xì)胞，可持續(xù)存在數(shù)年。干細(xì)胞的增殖和分化必須被嚴(yán)格調(diào)節(jié)W確保在 正常情況下W及當(dāng)細(xì)胞因疾病或損失原因被替換時(shí)能夠終生維持合適數(shù)量的特化細(xì)胞W 及自身干細(xì)胞小室。
[0012] 本發(fā)明提供一種遞送任何干細(xì)胞群的方法，特別是遞送確定性干細(xì)胞或其定向 祖細(xì)胞的方法，該方法借助直接注射或借助移植策略而將細(xì)胞遞送祀向至產(chǎn)生肝和膜腺 的干細(xì)胞巢儲(chǔ)庫(kù)。關(guān)于移植方法和干細(xì)胞培養(yǎng)物"補(bǔ)給效應(yīng)"的描述，參見(jiàn)美國(guó)專利申請(qǐng) 12/213, 100號(hào)和13/102, 939號(hào)，通過(guò)引用將運(yùn)兩份申請(qǐng)的公開(kāi)內(nèi)容全部合并至本文中。
[0013] 肝臟、膽管樹(shù)和膜腺是中腸內(nèi)胚層器官，是W下活動(dòng)的中屯、：處理糖原和脂質(zhì)代 謝、外來(lái)物質(zhì)解毒、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)加工w實(shí)現(xiàn)優(yōu)化利用、能量需求調(diào)節(jié)、w及各種因子（從凝固 蛋白到載體蛋白（如AFP、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白））合成。機(jī)體的完整性嚴(yán)重依賴于肝、膽管樹(shù) 和膜腺功能，它們中的任何一個(gè)的功能失效，特別是肝功能失效，會(huì)導(dǎo)致快速死亡。近年來(lái)， 明顯認(rèn)識(shí)到，運(yùn)些組織包含W上皮細(xì)胞-間充質(zhì)細(xì)胞關(guān)系存在的細(xì)胞的成熟譜系。每個(gè)譜 系樹(shù)開(kāi)始于伴有間充質(zhì)干細(xì)胞（如成血管細(xì)胞）的上皮干細(xì)胞（例如肝干細(xì)胞）。
[0014] 運(yùn)些細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同成熟的細(xì)胞子代。成熟過(guò)程產(chǎn)生上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞，它們 逐步改變其形態(tài)、倍性、生長(zhǎng)潛力、生物標(biāo)記物、基因表達(dá)和其他表型性狀。肝功能和膜腺功 能是整個(gè)成熟譜系中所有細(xì)胞的表型性狀的凈總和。在表1中，我們通過(guò)總結(jié)肝內(nèi)不同成 熟譜系階段的實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表型性狀而提供了代表性例子。我們假設(shè)了，在膜腺中，從干細(xì)胞 或祖細(xì)胞到成熟細(xì)胞具有可比較的譜系階段，但運(yùn)些并未完全確定。
[0015] 膜腺位于腹膜后并且向十二指腸提供消化酶，并提供調(diào)節(jié)代謝的激素。運(yùn)個(gè)器官 對(duì)于機(jī)械處理特別敏感，并且具有局部釋放其酶導(dǎo)致自溶的傾向。運(yùn)種趨勢(shì)限制了可在該 器官上進(jìn)行的手術(shù)類型，包括用于膜腺疾病或病癥的細(xì)胞療法。肝對(duì)于手動(dòng)操作沒(méi)有膜腺 敏感，但是肝臟需要腹部外科手術(shù)或腹腔鏡手術(shù)才能觸及，或借助內(nèi)窺鏡檢查而經(jīng)由膽管 樹(shù)來(lái)觸及。
[0016] 因此，本發(fā)明預(yù)期將細(xì)胞導(dǎo)入肝臟和膜腺，而不物理性地干擾或損害運(yùn)些器官的 物理完整性。
[0017] 發(fā)明概述
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種治療膜腺或肝功能素亂或病癥的方 法，所述方法包括：(a)分別獲得干細(xì)胞或其子代、定向祖細(xì)胞的懸液；和化）在膜腺的情況 下，將所述懸液導(dǎo)入到肝-膜腺總管的壁之內(nèi)或之上，或在肝臟的情況下，將所述懸液導(dǎo)入 到離肝較近的膽管樹(shù)的壁之內(nèi)或之上，其中大部分細(xì)胞駐留在壁內(nèi)，并且其中所述細(xì)胞成 熟為功能性膜腺細(xì)胞或肝細(xì)胞，并且遷移（假設(shè)通過(guò)"傳送帶"機(jī)制）至膜腺或肝，從而分 別治療膜腺或肝功能素亂或病癥。所述細(xì)胞可為膽管樹(shù)干細(xì)胞或其子代、定向祖細(xì)胞，或用 于肝和膜腺的間充質(zhì)干細(xì)胞，或用于肝的肝干細(xì)胞或定向祖細(xì)胞，或用于膜腺的膜腺干細(xì) 胞或其定向祖細(xì)胞。如果未來(lái)能夠成功控制ES細(xì)胞或iPS細(xì)胞的致瘤潛能而使得它們可 能用于臨床，那么它們也可能W運(yùn)種方式被遞送，從而治療肝臟或膜腺病癥。
[0019] 所述細(xì)胞懸液優(yōu)選可結(jié)合一種或多種生物材料（例如膠原、黏附分子、蛋白聚 糖、透明質(zhì)酸、糖胺聚糖鏈、殼聚糖、藻酸鹽、W及合成的、可生物降解的和生物相容性聚合 物，或它們的組合）、生長(zhǎng)因子（例如R-脊椎蛋白、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)、肝細(xì)胞生 長(zhǎng)因子化GF)、表皮生長(zhǎng)因子巧GF)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF)、膜島素樣生長(zhǎng)因子 I(IGF-1)、膜島素樣生長(zhǎng)因子II(IGF-2)、抑瘤素-M、白血病抑制因子化IF)、轉(zhuǎn)鐵蛋白、膜 島素、糖皮質(zhì)激素、生長(zhǎng)激素、雌激素、雄激素、甲狀腺素、垂體激素W及它們的組合）、其他 細(xì)胞、或它們的組合，W形成移植復(fù)合物。
[0020] 所述其他細(xì)胞可包含上皮干細(xì)胞W及它們的間充質(zhì)伴體（partners)。例如，膽管 樹(shù)干細(xì)胞（或肝干細(xì)胞）、成血管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及星狀細(xì)胞的前體細(xì)胞或它們的組合，并 且可來(lái)自于對(duì)象的未患病或未發(fā)生功能素亂的膽管樹(shù)的一部分，和/或來(lái)自于非自身供體 的膽管樹(shù)。根據(jù)該方法，所述移植復(fù)合物（細(xì)胞+生物材料+激素/生長(zhǎng)因子）可借助腹 腔鏡手術(shù)或內(nèi)窺鏡手術(shù)經(jīng)由注射而導(dǎo)入，或通過(guò)移植到膽管的表面上并且圍繞膽管具有生 物可降解覆蓋物而導(dǎo)入，或通過(guò)海綿（sponge)導(dǎo)入。
[0021] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種修復(fù)具有處于患病或功能素亂狀 態(tài)的膜腺的對(duì)象的肝臟或膜腺的功能的方法，所述方法包括：(a)獲得干細(xì)胞和/或定向祖 細(xì)胞的懸液；和化）在膜腺的情況下，將所述懸液引至肝-膜腺總管的壁，或在肝臟的情況 下，將所述懸液引至離肝臟較近的膽管壁，其中大部分導(dǎo)入的細(xì)胞在體內(nèi)分別W成熟膜腺 細(xì)胞或肝細(xì)胞的形式駐留在膜腺或肝臟的至少一部分之中或之上。
[0022] 該方法是基于下述理解而實(shí)現(xiàn)的：膽管樹(shù)內(nèi)的干細(xì)胞群是促成肝臟和膜腺的器官 形成的前體細(xì)胞。細(xì)胞譜系開(kāi)始于干細(xì)胞巢、膽囊周圍腺體內(nèi)，并在器官內(nèi)發(fā)育為成熟細(xì) 胞。膽管樹(shù)中的膽囊周圍腺體含有表現(xiàn)出構(gòu)成成熟譜系證據(jù)的表型性狀的細(xì)胞，從膽管壁 深處的干細(xì)胞群（靠近纖維肌層）到靠近膽管內(nèi)腔且鄰近肝臟或膜腺的成熟細(xì)胞。運(yùn)些細(xì) 胞已被表征并且其表型性狀隨著與器官的鄰近度的變化而變化。
[0023] 膽管樹(shù)是干細(xì)胞療法中細(xì)胞移植的合乎邏輯的祀標(biāo)。在膽管樹(shù)中存在著干細(xì)胞/ 祖細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，其沿徑向軸和由近至遠(yuǎn)軸W成熟譜系形式組織，該干細(xì)胞/祖細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在整 個(gè)生命期間有助于肝臟和膜腺的器官形成。利用膽管樹(shù)作為移植祀位的優(yōu)點(diǎn)有很多。移植 程序可W口診流程（例如內(nèi)窺鏡法）或W小型手術(shù)流程（腹腔鏡手術(shù)）的形式來(lái)進(jìn)行。運(yùn) 種策略使得干細(xì)胞或祖細(xì)胞的移植具有最小的（如果有的話）免疫原性，因此可W避免患 者服用免疫抑制藥物。該程序設(shè)及移植（grafting)策略，其已被證實(shí)有利于植入到祀器官 中；不同于現(xiàn)在許多通過(guò)血管途徑進(jìn)行細(xì)胞移植的研究者們所記載的在肝內(nèi)約20%的植 入（engraftment)，移植策略導(dǎo)致近100%的植入。運(yùn)避免了異位細(xì)胞分布（它是通過(guò)血管 途徑進(jìn)行細(xì)胞移植的嚴(yán)重顧慮），而且優(yōu)化供體細(xì)胞的使用（即避免細(xì)胞因死亡或異位細(xì) 胞分布而喪失）。
[0024] 運(yùn)些優(yōu)點(diǎn)對(duì)于膜腺治療是尤其深遠(yuǎn)的，因?yàn)槠鋵?duì)手動(dòng)操作的敏感性已排除了直接 進(jìn)入該器官的細(xì)胞療法的任何機(jī)會(huì)。移植到靠近膜腺的膽管樹(shù)的部分（肝-膜腺總管）的 干細(xì)胞克服了運(yùn)個(gè)主要的困難，使得膜腺的干細(xì)胞療法變成現(xiàn)實(shí)。
【附圖說(shuō)明】
[00巧]圖1是肝、膽管樹(shù)和膜腺的示意圖，顯示它們與十二指腸的連接關(guān)系。在膽管樹(shù)各 個(gè)部分都發(fā)現(xiàn)了壁內(nèi)和壁外膽囊周圍腺體（PBG)、膽管樹(shù)的干細(xì)胞巢。壁內(nèi)PBG在膽管壁內(nèi) 大量存在，位置為從膽管內(nèi)最內(nèi)部位置、靠近纖維肌層的位置，到最靠近膽管腔的位置。靠 近纖維肌層的PBG內(nèi)的細(xì)胞包含最大量的非常原生的（p