簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種可適用于石蠟包埋樣本等低質(zhì)量樣本 的、簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA甲基化是基因組DNA的一種最常見的表觀遺傳修飾，大量研究表明DNA甲基 化修飾對于維持正常細胞功能、傳遞基因組遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生等起著 至關(guān)重要的作用。伴隨著高通量測序的誕生，對DNA甲基化的研究越來越深入，作為DNA 甲基化檢測的金標準全基因組重亞硫酸鹽測序WGBS或BS-Seq(Whole genome bisulfate sequencing)[1]，能夠?qū)θ蚪MDNA甲基化進行分析，并且具備了單堿基水平的檢測靈敏 度。然而，正是由于BS-Seq能夠?qū)θ蚪M甲基化檢測，也導致了測序深度高、測序費用高 等弊端。
[0003] 2005 年AlexanderMeissner等[2]在NucleicAcidsResearch首次提出簡化的 表觀重亞硫酸氫鹽測序技術(shù)（RRBS，ReducedRepresentationBisulfiteSequencing)，該 方法通過MspI酶切富集啟動子及CpG島區(qū)域，并進行Bisulfite測序，同時實現(xiàn)CpG位點 的單堿基精度檢測的高分辨率和測序數(shù)據(jù)的高利用率。RRBS作為一種高性價比的甲基化研 究方法，可以實現(xiàn)多個樣本的比對基因組分析，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng) 用前景。
[0004] 目前，RRBS測序技術(shù)主要用于人和小鼠，需要2-5ug基因組DNA起始構(gòu)建文庫。傳 統(tǒng)的RRBS文庫構(gòu)建方法如下：
[0005] (1)gDNA酶切：2 ~5μg基因組DNA起始量，采用MspI酶切g(shù)DNA，QIA-quickPCR PurificationKit過膜純化；
[0006] (2)末端修復：以dNTP為單核苷酸來源，采用T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶和 Klenow片段對酶切后的粘性末端修復成平末端，QIA-quickPCRPurificationKit過膜純 化；
[0007] (3)加"A"：以dATP為單核苷酸來源，采用Klenow片段（3'-5'ex〇-)為平末端3' 端加A，QIA-quickPCRPurificationKit過膜純化；
[0008] (4)加"甲基化接頭":采用T4DNA連接酶將帶T的甲基化接頭連接在含A的DNA 片段兩端，QIA-quickPCRPurificationKit過膜純化；
[0009] (5)片段篩選：采用瓊脂糖凝膠電泳回收150-325bp范圍內(nèi)的片段，QIA-quick GelExtractionKit進行膠純化回收；
[0010] (6)重亞硫酸氫鹽處理：加入一定比例λ-DNA至膠回收產(chǎn)物作為對照，采用EZ DNA Methylation-Gold Kit對膠回收產(chǎn)物進行Bisulfite反應(yīng)；
[0011] (7)PCR擴增：米用ΚΑΡΑHiFiHotStartUracil+ReadyMix對Bisulfite產(chǎn)物進 行PCR擴增，擴增產(chǎn)物Ampure磁珠純化，文庫構(gòu)建完成；
[0012] (8)文庫質(zhì)控：對文庫進行2100峰圖和QPCR質(zhì)控，合格后高通量測序；
[0013] (9)上機測序：根據(jù)需求選擇測序策略和測序數(shù)據(jù)量。
[0014] RRBS測序技術(shù)的高性價比贏得了科研工作者的青睞，特別在多樣本分析方面得到 廣泛的應(yīng)用，取得了較好的成效。然而，在實際應(yīng)用過程中，RRBS也顯示出一定的局限性， 存在的主要問題是：
[0015] (1)對于石蠟包埋樣本或其他低質(zhì)量樣本，數(shù)據(jù)浪費嚴重，數(shù)據(jù)利用率低；
[0016] (2)RRBS建庫一般要求起始樣本的gDNA量為2~5μg，這使得珍貴的（一般而言 都是少量的）臨床樣本，很難達到建庫起始量的要求。
[0017] 參考文獻
[0018] [1]Li, N. , et al. , Whole genome DNA methylation analysis based on high throughput sequencing technology. Methods. 2010. 52(3):p. 203-12.
[0019] [2] Alexander Meissner, Andreas Gnirke, George W. Bell, et al. Reduced representation bisulfite sequencingfor comparative high-resolution DNA methylation analysis. Nucleic Acids Research. 2005, 33(18):5868-5877.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠適用于石蠟包 埋樣本等低質(zhì)量樣本的、簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法及建庫試劑盒。
[0021] 本發(fā)明人為解決上述問題進行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過在末端修復步驟中使 用dCTP、dGTP與dATP的適當比例的混合物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的dNTP提供單脫氧核糖核苷酸、且將 末端修復步驟與加A步驟合并進行，可是實現(xiàn)適用于石蠟包埋樣本等低質(zhì)量樣本的、簡化 的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法，從而完成了本發(fā)明。
[0022] 即，本發(fā)明包括：
[0023]1.-種簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的構(gòu)建方法，該方法包括：
[0024] 步驟A:用MspI限制性內(nèi)切酶處理基因組DNA，得到酶切產(chǎn)物；
[0025] 步驟B:將所述酶切產(chǎn)物進行末端修復及3'端加A，得到3'端加A的DNA片段，其 中，所述末端修復中使用dCTP、dGTP與dATP的混合物提供單脫氧核糖核苷酸，該混合物中 dCTP:dGTP:dATP的摩爾比為1:1:5~1:1:20，且該混合物中不包含dTTP;
[0026] 步驟C:將所述3'端加A的DNA片段加甲基化接頭，得到加甲基化接頭的DNA片 段；
[0027] 步驟D:將所述加甲基化接頭的DNA片段進行重亞硫酸氫鹽處理，得到重亞硫酸氫 鹽處理產(chǎn)物；
[0028] 步驟E:所述重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；
[0029] 步驟F:將所述PCR擴增產(chǎn)物進行片段篩選。
[0030] 2.根據(jù)項1所述的方法，其中，所述步驟A中的基因組DNA的量為50~500ng。
[0031] 3.根據(jù)項1或2所述的方法，其中，所述步驟A中的基因組DNA來自于低質(zhì)量樣 本。
[0032] 4.根據(jù)項3所述的方法，其中，所述低質(zhì)量樣本是石蠟包埋樣本。
[0033]5.根據(jù)項1~4中任一項所述的方法，其中，所述步驟B中的所述混合物中，dCTP: dGTP:dATP的摩爾比為 1:1:9 ~1:1:11。
[0034] 6.根據(jù)項1~5中任一項所述的方法，其中，所述步驟B中采用包含所述酶切產(chǎn) 物、缺失外切酶活性的Klenow片段、所述混合物以及反應(yīng)緩沖液的反應(yīng)體系，進行末端修 復及3'端加A;
[0035] 反應(yīng)條件為30~50°C、0. 5~12小時。
[0036] 7.根據(jù)項1~6中任一項所述的方法，其中，所述步驟C中采用包含所述3'端加 A的DNA片段、連接反應(yīng)緩沖液、甲基化接頭以及T4DNA連接酶的反應(yīng)體系，進行加甲基化 接頭；
[0037] 反應(yīng)條件為10~30°C、0. 5~5小時。
[0038] 8.根據(jù)項1~7中任一項所述的方法，其中，在所述步驟A與步驟B之間、步驟B 與步驟C之間、和/或步驟C與步驟D之間任選還包括產(chǎn)物純化步驟。
[0039] 9. -種用于構(gòu)建簡化的表觀重亞硫酸氫鹽測序用文庫的試劑盒，其用于實施項 1~8中任一項所述的方法，其包括：
[0040] 用于對所述酶切產(chǎn)物進行末端修復的試劑，該試劑包括dCTP、dGTP與dATP的混合 物，該混合物中dCTP:dGTP:dATP的摩爾比為1:1:5~1:1:20,且該混合物中不包含dTTP。
[0041] 10.根據(jù)項9所述的試劑盒，其還包括選自下組中的至少一種或全部：
[0042] 用于對所述基因組DNA進行MspI限制性內(nèi)切酶處理的試劑；
[0043] 用于所述3'端加A的試劑；
[0044] 用于將所述3'端加A的DNA片段加甲基化接頭的試劑；
[0045] 用于對所述加甲基化接頭的DNA片段進行重亞硫酸氫鹽處理的試劑；
[0046] 用于對重亞硫酸氫鹽處理產(chǎn)物進行PCR擴增的試劑；和
[0047] 用于將所述PCR擴增產(chǎn)物進行片段篩選的試劑。