一種剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法
【專利說明】一種剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于剛地弓形蟲疫苗研究領(lǐng)域新技術(shù)，尤其涉及一種弓形蟲卵囊制備、純化及保存方法。
【背景技術(shù)】
[0003]弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生原蟲，能寄生在除紅細(xì)胞外的所有有核細(xì)胞內(nèi)，隨血液和淋巴液擴(kuò)散至全身各部位。中間宿主廣泛且無特異性，終末宿主僅限于貓或貓科動(dòng)物。弓形蟲病是一種危害巨大的人畜共患疾病，在中國屬二類動(dòng)物疫病。
[0004]弓形蟲作為重要的機(jī)會(huì)性致病原蟲，正常人和動(dòng)物感染弓形蟲后多呈隱性感染，一般不引起明顯癥狀，但可在體內(nèi)長期潛伏，但如果發(fā)生在胎兒、機(jī)體免疫功能受損或缺陷的患者(如器官移植、艾滋病及惡性腫瘤患者)，潛伏感染可以被激活，從而引起嚴(yán)重的甚至危及生命的疾病，對(duì)人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展構(gòu)成嚴(yán)重威脅。弓形蟲病是人畜先天性疾病和流產(chǎn)的原因之一，還可引起腦炎和視網(wǎng)膜炎。
[0005]剛地弓形蟲是寄生于貓的一種腸道球蟲，貓科動(dòng)物可以排泄剛地弓形蟲卵囊，為終末宿主，恒溫動(dòng)物均為中間宿主。弓形蟲的有性生殖和無性生殖階段均可發(fā)生于貓，除貓以外的宿主只有無性生殖階段。未孢子化的卵囊隨貓科動(dòng)物糞便排出，卵囊在溫暖的環(huán)境和適宜的濕度中，孢子化形成兩個(gè)子包囊。在每個(gè)子包囊內(nèi)有四個(gè)子孢子。環(huán)境中的子孢子可在卵囊內(nèi)存活數(shù)月。人或動(dòng)物攝食孢子化的卵囊后，子孢子進(jìn)入腸道內(nèi)形成裂殖體。裂殖子在裂殖體內(nèi)的數(shù)量從兩個(gè)到幾百個(gè)不等。侵染的宿主細(xì)胞破裂時(shí)，裂殖子從裂殖體內(nèi)釋放出來繼續(xù)侵染其他細(xì)胞。
[0006]目前，對(duì)于弓形蟲病的預(yù)防和治療尚無有效方法，因此關(guān)于此方面也在進(jìn)行積極的研究。弓形蟲卵囊可在外界環(huán)境中長期保存，保存期較長，是良好的疫苗研究和制備素材，因此如何制備剛地弓形蟲卵囊，如何純化及保存剛地弓形蟲卵囊也是目前科研人員一個(gè)重要的研究課題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為了提供弓形蟲疾苗的制備素材，本發(fā)明的目的是提供一種工藝簡單、操作方便制作成本低的弓形蟲卵囊制備、純化及保存方法。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是以下述方式實(shí)現(xiàn)的:
1、一種剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法，包括以下步驟:
A、弓形蟲包囊的獲得；用不同種類的鮮肉作為樣品并進(jìn)行標(biāo)號(hào)，將每種類樣品制作若干張壓片，10倍顯微鏡下“S”形檢查壓片、發(fā)現(xiàn)組織弓形蟲包囊、記錄樣品標(biāo)號(hào)、并標(biāo)記為弓形蟲包囊陽性樣品，弓形蟲包囊特征為圓形，包囊壁1 μπι，包囊內(nèi)含有致密的呈香蕉狀的緩殖子； B、弓形蟲陰性貓的獲得；對(duì)2月齡健康貓進(jìn)行微量采集足部血液，血液吸于濾紙上，用ELISA方法檢測血清內(nèi)抗弓形蟲抗體，選出弓形蟲抗體陰性貓；
C、弓形蟲包囊飼喂貓；對(duì)弓形蟲抗體陰性貓飼喂貓糧，待精神穩(wěn)定后，飼喂弓形蟲包囊陽性樣品；
D、收集1-21天糞便:弓形蟲抗體陰性貓食入弓形蟲包囊陽性樣品后，每日收取貓糞便，標(biāo)記糞便日期，存放于4度冰箱；
E、從糞便分離弓形蟲卵囊:
(1)將收集的糞便加適量清水濕潤；
(2)繼續(xù)加清水搗碎糞便結(jié)塊直至均勻。
[0009](3)用雙層紗布將加水形成均勻液體的糞便過濾、并用清水沖洗；
(4)濾液倒入離心管中，離心；
(5)棄去上清液；
(6)在沉淀物中加入濃度為530g/L蔗糖溶液混勻；沉淀物與蔗糖溶液的體積比是:沉淀物:蔗糖溶液=1:10-40 ；
(7)將(6)中的混勻的液體混合物離心；
(8)用一次性移液管從(7)的離心管的上部取少量樣品進(jìn)行顯微鏡檢查；
(9)如鏡檢發(fā)現(xiàn)卵囊，則用大口吸管輕吸離心管上部液體5ml，加清水至50ml，離心；
(10)去除上清，加2%硫酸按體積比，沉淀液:比硫酸溶液=1: 10，放置搖床7天，等待卵囊孢子化，孢子化的弓形蟲特征是每個(gè)包囊內(nèi)有2個(gè)子孢子；
F、弓形蟲卵囊的保存；將(10)中的孢子化的卵囊置于有螺旋口離心管內(nèi)。
[0010]在上述剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法中優(yōu)選條件
D、收集1-10天糞便:弓形蟲抗體陰性貓食入弓形蟲包囊陽性樣品后，每日收取貓糞便，標(biāo)記糞便日期，存放于4度冰箱；
E、從糞便分離弓形蟲卵囊:
(7)將(6)中的混勻的液體混合物離心，離心速度為2000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為10分鐘；
(9)如鏡檢發(fā)現(xiàn)卵囊，則用大口吸管輕吸離心管上部液體5ml，加清水至50ml，離心速度為2000轉(zhuǎn)/分，時(shí)間為10分鐘；
F、弓形蟲卵囊的保存；將(10)中的孢子化的卵囊置于有螺旋口離心管內(nèi)，離心管內(nèi)含少量空氣冰箱。
[0011]上述剛地弓形蟲卵囊的制備、純化及保存方法，還包括以下步驟:
G、卵囊污染材料的安全化處理。
[0012]—次性用品燒毀，其余物品用100度熱水，浸泡5分鐘或高壓滅菌，壓力為121Pa，時(shí)間為15min后再丟棄。
[0013]本發(fā)明的積極效果是:
1、弓形蟲卵囊活性好，可長期保存于4度冰箱，保存期大于5年，能提供良好的弓形蟲疫苗研究和制備素材。
[0014]2、該方法人工操作簡便易行，所采用的材料易于得到。
[0015]3、制備及純化弓形蟲卵囊過程易于控制，范圍較小，并對(duì)接觸過的材料、器皿進(jìn)行無害化處理，避免了對(duì)環(huán)境污染。
[0016]【附圖說明】:
圖1為本發(fā)明采用Olympus光學(xué)顯微鏡CX21，物鏡10倍的弓形蟲包囊圖；
圖2為本發(fā)明采用Olympus光學(xué)顯微鏡CX21，物鏡40倍的弓形蟲包囊圖；
【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說明實(shí)施例一:
A、弓形蟲包囊的獲得:
購買新鮮豬肉500克、雞肉500克、新鮮豬腦500克、雞頭全部，對(duì)樣品進(jìn)行標(biāo)號(hào)，制作組織壓片，每個(gè)樣品制作10張壓片，10倍顯微鏡下“S”形檢查壓片，發(fā)現(xiàn)組織弓形蟲包囊，記錄樣品標(biāo)號(hào)，并標(biāo)記為弓形蟲包囊陽性樣品。弓形蟲包囊特征為圓形，包囊壁1 ym，包囊內(nèi)含有致密的呈香蕉狀的緩殖子。
[0017]