鑒定飼用燕麥國(guó)審品種的方法及其專用引物組的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種鑒定飼用燕麥國(guó)審品種的方法及其專用 引物組。
【背景技術(shù)】
[0002] 種及品種鑒定是種子質(zhì)量檢測(cè)工作中的一項(xiàng)重要內(nèi)容，其主要目的是確定送驗(yàn)樣 品與所聲明的種或品種的符合程度。隨著近年來(lái)種子市場(chǎng)貿(mào)易量的增加，國(guó)內(nèi)種子經(jīng)營(yíng)者 片面追求經(jīng)濟(jì)效益而忽視質(zhì)量，利用其他品種滲雜使假，不僅造成給經(jīng)濟(jì)損失，還引起市場(chǎng) 上品種混亂，難辨真?zhèn)?，使真正的?yōu)良品種無(wú)法得到有效保護(hù)，縮短了品種的利用年限。因 此，準(zhǔn)確可靠、快速簡(jiǎn)便的品種鑒定方法備受關(guān)注。SSR分子標(biāo)記技術(shù)是一口新興的技術(shù)，它 是W個(gè)體間遺傳物質(zhì)內(nèi)核巧酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標(biāo)記技術(shù)，是DNA水平遺傳多態(tài)性的 直接反映。與其他遺傳標(biāo)記技術(shù)相比，SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有信息豐富、檢測(cè)快速準(zhǔn)確、易 于標(biāo)準(zhǔn)化操作等特點(diǎn)，十分適合用來(lái)進(jìn)行植物品種鑒定和分析。
[0003] 燕麥（Avenaspp.)為一年生禾本科早熟禾亞科燕麥屬植物，是重要的牧草、飼料 和糧食作物，廣泛分布于全世界五大州40多個(gè)國(guó)家，我國(guó)燕麥每年實(shí)際種植面積在100萬(wàn) hm2左右，主要分布在華北北部的冀、晉、蒙的高寒山區(qū)、西北的六盤山麓和云貴川的高締 度、高海撥的高寒山區(qū)，它是人類和動(dòng)物可直接利用的優(yōu)質(zhì)糧食及飼料作物之一。燕麥主要 有皮燕麥（亦稱有殼燕麥，Avenasativa)、裸燕麥（亦稱無(wú)殼燕麥，Avenanuda)和野燕麥 等種。皮燕麥主要用于生產(chǎn)巧實(shí)精飼料和飼草，通常稱為飼用燕麥。目前通過(guò)全國(guó)草品種 審定委員會(huì)審定的飼用燕麥品種有10個(gè)，分別為丹麥444、鋒利、哈爾滿、馬匹牙、青引1號(hào)、 青引2號(hào)、青早1號(hào)、蘇聯(lián)、晚燕3號(hào)和阿巧。
[0004] 在一些主要農(nóng)作物如玉米、大豆、小麥、大麥等已經(jīng)建立起了品種鑒定的快速檢測(cè) 方法，但目前在燕麥中還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道。鑒于SSR引物的種間特異性，迫切需要開(kāi)發(fā)用于檢 測(cè)飼用燕麥國(guó)審品種的專用引物和建立相應(yīng)的檢測(cè)流程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是如何鑒定待測(cè)草種為或候選為哪種燕麥國(guó)審品種。
[0006] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了鑒定待測(cè)草種為或候選為哪種燕麥國(guó)審品種 的專用引物組。
[0007] 本發(fā)明所提供的鑒定待測(cè)草種為或候選為哪種燕麥國(guó)審品種的引物組，可為如下 (el)、（e2)、（e3)或（e4)中的任一種：
[0008] (el)引物對(duì)P04;
[0009] (e2)由引物對(duì)POl、引物對(duì)P02、引物對(duì)P03、引物對(duì)P04、引物對(duì)P05和引物對(duì)P06 組成；
[0010] (e：3)引物對(duì)P05; 1 ] (e4)引物對(duì)PO1、引物對(duì)P02、引物對(duì)P03、引物對(duì)P06或由下述六個(gè)引物對(duì)中的任 五對(duì)、任四對(duì)、任=對(duì)、任兩對(duì)組成：引物對(duì)POI、引物對(duì)P02、引物對(duì)P03、引物對(duì)P04、引物對(duì)P05和引物對(duì)P06。 陽(yáng)01引所述引物對(duì)POl可由序列表中序列1所示的單鏈DNA分子和序列表中序列2所示 的單鏈DNA分子組成； 陽(yáng)01引所述引物對(duì)P02可由序列表中序列3所示的單鏈DNA分子和序列表中序列4所示 的單鏈DNA分子組成；
[0014] 所述引物對(duì)P03可由序列表中序列5所示的單鏈DNA分子和序列表中序列6所示 的單鏈DNA分子組成；
[0015] 所述引物對(duì)P04可由序列表中序列7所示的單鏈DNA分子和序列表中序列8所示 的單鏈DNA分子組成；
[0016] 所述引物對(duì)P05可由序列表中序列9所示的單鏈DNA分子和序列表中序列10所 示的單鏈DNA分子組成；
[0017] 所述引物對(duì)P06可由序列表中序列11所示的單鏈DNA分子和序列表中序列12所 示的單鏈DNA分子組成。
[0018] 所述引物組可包括所述引物對(duì)P04;所述引物組還可包括所述引物對(duì)P01、所述引 物對(duì)P02、所述引物對(duì)P03、所述引物對(duì)P05和所述引物對(duì)P06中的至少一對(duì)。
[0019] 所述引物組可包括所述引物對(duì)P05;所述引物組還可包括所述引物對(duì)P01、所述引 物對(duì)P02、所述引物對(duì)P03、所述引物對(duì)P04和所述引物對(duì)P06中的至少一對(duì)。
[0020] 本發(fā)明還提供了用于鑒定待測(cè)草種為或候選為哪種燕麥國(guó)審品種的方法。
[0021] 所述"用于鑒定待測(cè)草種為或候選為哪種燕麥國(guó)審品種的方法"具體可為方法 一，包括如下步驟：W待測(cè)草種的基因組DNA為模板，分別采用所述引物對(duì)P01、所述引物對(duì) P02、所述引物對(duì)P03、所述引物對(duì)P04、所述引物對(duì)P05和所述引物對(duì)P06進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然 后按照如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷：
[0022] (al)采用所述引物對(duì)POl進(jìn)行PCR擴(kuò)增：如果得到197bp和199bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待 測(cè)草種為或候選為馬匹牙或鋒利，如果得到2nbp、219bp和22化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為 或候選為阿巧，如果得到213bp和215bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為丹麥444,如果得 到217bp和219bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為青引2號(hào)或青早1號(hào)，如果得到21化P 和2Ubp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為青引1號(hào)、蘇聯(lián)、哈爾滿或晚燕3號(hào)； 陽(yáng)02引（曰2)采用所述引物對(duì)P02進(jìn)行PCR擴(kuò)增：如果得到179bp和182bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、 待測(cè)草種為或候選為馬匹牙；如果得到19化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為阿巧、青引 2號(hào)、青引1號(hào)、哈爾滿或青早1號(hào)；如果得到179bp和IWbp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候 選為丹麥444或晚燕3號(hào)；如果得到194bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為鋒利；如果得 到179bp和19化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為蘇聯(lián)；
[0024](曰3)采用所述引物對(duì)P03進(jìn)行PCR擴(kuò)增：如果得到238bp和248bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、 待測(cè)草種為或候選為馬匹牙；如果得到240bp和244bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為阿 巧；如果得到242bp和244bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為丹麥444、青引2號(hào)或青引1 號(hào)；如果得到240bp和24化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為鋒利；如果得到24化P的擴(kuò) 增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為蘇聯(lián)；如果得到244bp和24化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候 選為哈爾滿或青早1號(hào)；如果得到246bp和25化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為晚燕3 號(hào)； 陽(yáng)02引（曰4)采用所述引物對(duì)P04進(jìn)行PCR擴(kuò)增：如果得到132bp、136bp和148bp的擴(kuò) 增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為馬匹牙；如果得到14化P、14化p、148bp和15化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、 待測(cè)草種為或候選為阿巧；如果得到13化P、HObp和148bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候 選為丹麥444 ;如果得到146bp和148bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為鋒利；如果得到 144bp、148bp和152bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為青引2號(hào)；如果得到142bp和14化P 的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為蘇聯(lián)；如果得到14化p、144bp和148bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè) 草種為或候選為青引1號(hào)；如果得到14化P、144bp、146bp和148bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為 或候選為哈爾滿；如果得到134bp、144bp和148bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為晚燕3 號(hào)；如果得到144bp和148bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為青早1號(hào)；
[0026](曰5)采用所述引物對(duì)P05進(jìn)行PCR擴(kuò)增：如果得到120bp、122bp、142bp、144bp 和15化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為馬匹牙；如果得到124bp、12化p、128bp、13化P、 132bp、142bp、144bp和16化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為阿巧；如果得到124bp、 126bp、128bp、136bp、138bp、140bp、142bp和160bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為丹麥 444 ;如果得到120bp、12化p、138bp、140bp和156bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為鋒利； 如果得到124bp、12化p、128bp、130bp、13化p、14化p、144bp和168bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種 為或候選為青引2號(hào)；如果得到12化P、124bp、12化P、14化P、142bp和156bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待 測(cè)草種為或候選為蘇聯(lián)；如果得到13化P、13化P、14化P、14化P和160bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草 種為或候選為青引1號(hào)；如果得到13化p、13化p、14化p、142bp和158bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草 種為或候選為晚燕3號(hào)；如果得到124bp、12化P、13化P、13化P、14化P、144bp和16化P的擴(kuò) 增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為青早1號(hào)；如果均不能獲得擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為哈 爾滿；
[0027] (曰6)采用所述引物對(duì)P06進(jìn)行PCR擴(kuò)增：如果得到138bp和14化P的擴(kuò)增產(chǎn)物、待 測(cè)草種為或候選為馬匹牙；如果得到138bp、14化P、142bp、144bp和146bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè) 草種為或候選為阿巧；如果得到14化p、144bp、14化p、148bp、150bp和152bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待 測(cè)草種為或候選為丹麥444 ;如果得到148bp和150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種為或候選為鋒 利、青引2號(hào)、蘇聯(lián)、青引1號(hào)或晚燕3號(hào)；如果得到156bp和158bp的擴(kuò)增產(chǎn)物、待測(cè)草種 為或