周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp60的cDNA全長序列及應用
【專利說明】周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60的cDNA全長序列及應用
[0001] 本發(fā)明得到：國家自然科學基金（31201730);天津市高等學?？萍及l(fā)展計劃項目 (20110602);天津師范大學博±基金（52XB1003)及天津市動植物抗性重點實驗室開放基金 的資助。
技術領域
[0002] 本發(fā)明屬于分子生物技術領域，研究周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60的CDNA全長序列 和不同溫度下化p60表達的變化。
【背景技術】
[0003]熱激蛋白化atshockprotein化sp)是一類在生物體內(nèi)廣泛存在的，對體內(nèi)外 環(huán)境變化極為敏感的高保守性蛋白質(zhì)，廣泛參與了各種生理代謝途徑，近年來已成為生物 研究領域中的一個熱點。根據(jù)其分子量的大小可將其分為不同的蛋白家族，其中Hsp60與 溫度脅迫應激性密切相關。溫度是影響生物體生存至關重要的環(huán)境因子，只有在一定的溫 度范圍內(nèi)生物體才能進行物質(zhì)能量代謝W維持正常生理活動，超出溫度的耐受范圍都會使 生物的生長發(fā)育停滯甚至死亡。一般來說生物體受到高溫或低溫刺激后，蛋白合成量會有 顯著變化，用W增強抗逆境能力。由于熱激蛋白會在脅迫消除后一段時間內(nèi)保持一定的含 量使生物體更好生存，可W認為其存在對于生物體適應環(huán)境有著重要作用。
[0004]周氏曬小蜂紐(旭ioiaYang是我國重要入侵物種美國白蛾巧 (化ury)的重要寄生性天敵，體長1.1-1. 5mm，群集內(nèi)寄生于美國白蛾蛹中，是抑制 美國白蛾的主要天敵因子，對控制美國白蛾的危害起到重要作用。除寄生于美國白蛾外，還 可寄生于鱗翅目的枯葉蛾科、毒蛾科、舟蛾科、尺蛾科、菜蛾科和雙翅目的蛹科、寄蛹科及銷 翅目的葉甲科和瓢甲科等。
[0005]通過野外釋放C 可W達到有效防治美國白蛾的目的。然而，在野外環(huán)境 下，C 的活力會受到多重因素的影響，其中，溫度作為一個主要生態(tài)因素，會影響C 的生命力。在合適的溫度范圍投放小蜂，才會起到更好的防治效果。本發(fā)明通過轉(zhuǎn)錄 組測序，報道了一個周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60的CDNA全長序列，該序列可為深入研究周 氏曬小蜂的溫度耐受性機制奠定基礎。通過實時巧光定量PCR方法，研究不同溫度下白蛾 周氏曬小蜂化p60基因表達的變化，研究結(jié)果可為科學利用天敵昆蟲周氏曬小蜂提供理論 基礎。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是報道一個周氏曬小蜂熱激蛋白基因Hsp60基因的cDNA全序列及 其對于溫度協(xié)迫的影響。
[0007] 本發(fā)明采用的技術方案是通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得周氏曬小蜂熱激蛋白基因Hsp60 基因的全序列，在通過RT-qPCR的方法研究不同溫度下Hsp60基因表達的變化。
[000引為此本發(fā)明公開了如下的技術內(nèi)容： 周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60的核巧酸序列，該序列全長1716bp，含完整的開放閱讀 框，具有SEQIDNO. 1所示的核巧酸序列。對應的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示；該序列 編碼571個氨基酸，分子量為60. 7邸曰，等電點為5. 44。
[0009] 本發(fā)明進一步公開了周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60的核巧酸序列在用于檢測防治 美國白蛾病方面的應用。所述防治美國白蛾指的是：Hsp60基因表達受溫度調(diào)控，通過檢測 Hsp60基因的表達情況，可W得知周氏曬小蜂對于溫度脅迫的耐受情況，在低于周氏曬小蜂 承受極限溫度下釋放小蜂，可W更好的起到防治美國白蛾的目的。通過實時巧光定量PCR 方法，研究不同溫度下白蛾周氏曬小蜂化p60基因表達的變化，研究結(jié)果可為科學利用天 敵昆蟲周氏曬小蜂提供理論基礎。
[0010] 周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60基因，其cDNA序列和編碼氨基酸的序列如序列表1、表 2所示。
[0011] 序列表

本發(fā)明公開的周氏曬小蜂熱激蛋白Hsp60的cDNA全長序列的優(yōu)點在于： (1)本發(fā)明是在國內(nèi)外首次公開周氏曬小蜂化p60基因的CDNA全序列，該序列可為深 入研究周氏曬小蜂的溫度耐受性機制奠定基礎。
[001引 （1)在通過RT-qPCR的方法研究不同溫度下化p60基因表達的變化，結(jié)果顯示在 不同溫度條件下周氏曬小蜂體內(nèi)的Hsp60基因的表達水平處于一個動態(tài)過程中，高溫和低 溫脅迫都使周氏曬小蜂體內(nèi)Hsp60有一個高的表達量，在40°C和-7°C體內(nèi)表達量最大。因 此本發(fā)明的提出研究了周氏曬小蜂適應外界環(huán)境的變化，避免受到脅迫因子對自身的傷害 的保護機制，對于防治美國白蛾有重大意義，為綠色防治林業(yè)害蟲提供了一個新的思路和 技術。
【附圖說明】
[0013] 圖1為周氏曬小蜂化p60在相同時間不同溫度脅迫下表達變化。
【具體實施方式】
[0014] 下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明，運里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領域的專 業(yè)人員按照本發(fā)明的精神可W對其進行改進和變化，所述的運些改進和變化都應視為在本 發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權利要求來限定；其中所用試劑均有市售。本發(fā)明中 所述的提取白蛾周氏曬小蜂總RNA的提取，CDNA的合成，實時巧光定量RT-qPCR等方法都 是本領域成熟的技術，試劑盒TransSc;ript?RT、TransSta;rt?TopGreenqPCRSuperMix等 都可W從生產(chǎn)商家購買。
[001引實施例1 : 獲得白蛾周氏曬小蜂Hsp60基因序列 實驗材料取自室內(nèi)傳代培養(yǎng)的白蛾周氏曬小蜂(培養(yǎng)條件：于人工氣候箱（PQX-350H) 中，溫度25°C，相對濕度60%~80%，無光黑暗)。取羽化后24h內(nèi)的雌性周氏曬小蜂，于解剖 鏡下切取觸角，立即浸于RNAlater(Ambion公司，AM7020)中；每200頭雌性白蛾周氏曬小 蜂的觸角膽存于一個1. 5mL離屯、管中，共捜集8管樣品，并于-2(TC下低溫保存，樣品制備 完成后送華大基因科技服務有限公司化ttp://www.genomics,cn/index)進行轉(zhuǎn)錄組測序。
[0016] 應用高通量測序平臺IlluminaHiSeqTM2000對周氏曬小蜂觸角樣本進行轉(zhuǎn)錄組 測序，采用Trinity軟件對每個讀取序列片段進行聚類后拼接成unigene，再結(jié)合生物信 息學軟件進行祀標序列cDNA全長的判定，進行Blast同源序列檢索予W確認，得到化p60 基因cDNA序列和編碼氨基酸的序列。
[0017] 實施例2: 總RNA的提取 選取30頭左右白蛾周氏曬小蜂進行不同溫度處理，高溫處理（Ih)為28°C、32°C、36°C、 4〇°c和42°c;低溫處理（比）為irc、6°c、rc、-3°C、-7°C。處理后產(chǎn)物立即使用或保存 于-20 °C冷凍。
[0018] (1)取30頭左右白蛾周氏曬小蜂置于1. 5血的無菌離屯、管內(nèi)，倒入液氮并迅速用 研磨棒進行充分研磨。將600JiL化izon溶液加入離屯、管，靜置5min。
[0019] (2)將200yL氯仿加入離屯、管，劇烈振蕩15s，靜置3min。
[0020] (3) 4°C下1200化pm離屯、15min，將上層無色水相轉(zhuǎn)入新無菌離屯、管中，加入 400JiL異丙醇，-20°C下放置 20min，12000巧m離屯、lOmin。
[0021] (4)小屯、倒掉管中液體，保留沉淀，加入600yL75%乙醇洗涂沉淀。4°C下7500巧m 離屯、5min，再重復一次乙醇洗涂沉淀操作。
[0022] (5)小屯、棄去上清液，室溫干燥2min。將RNA沉淀溶于20JiLRelutionBuffer中， 必要時可55°C-60°C水浴IOmin。
[0023] (6)所得沉淀即為白蛾周氏曬小峰總RNA，產(chǎn)物立即使用或冷凍保存于-70°C 實施例3 : cDNA的合成 W實施例2所述白蛾周氏曬小蜂總RNA作為模板。取一消毒的0.2mL離屯、管，加入W下反應體系（20JiL體系）：TotalRNA5JiL,orRandomPrimer(N9) (0.1Hg/JiDlyL， 2XTSReactionMixIOuL，TransScript?RT/RIEnzymeMixIuL，RNase-freeWater 3yL，混勻。
[0024] 反應條件為25°C水浴保溫10分鐘，42°C水浴保溫30分鐘，85°C高溫加熱5分鐘， W使離屯、管中存留的TransScript?RT失去活性。產(chǎn)物立即使用或保存于-20°C冷凍。
[002引 實施例4 : 巧光定量PCR反應體系和條件 (1) 引物設計：根據(jù)所得化p60基因的全長序列，使用Primer5軟件設計適用于實時 巧光PCR檢測的特異性引物，引物序列如下：
(2) 實時巧光PCR:運用SYBRGreen嵌合巧光法進行RT-PCR分析。使用CF96XPCR儀 (Bio-Rad)進行PCR反應。W上述實施例3中合成的CDNA為模板，用上述（1)中所設計的 特異性引物，進行實時巧光PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，擴增后所得3個平行管 的Ct值(即每個反應管內(nèi)的巧光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的反應循環(huán)數(shù)）取平均數(shù)。
[0026] 實時巧光PCR擴增體系設置如下：
實時巧光PCR擴增參數(shù)設置如下： 50°C120s； 95°C120s;95°CIs;60°C30s(40 個循環(huán)）； 白蛾周氏曬小蜂在不同溫度下Hsp60基因相對表達量計算： 當目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率相近時，采用廠& &ET法計算各個溫度下化p6〇基因 的mRNA相對表達量，用SPSS19. 0軟件進行單因素方差分析，Duncan氏新復極差法檢驗 不同處理間差異顯著性。
[0027]圖I為不同溫度下周氏曬小蜂Hsp60基因的相對表達量。從圖中看出無論是高溫 還是低溫都可W影響周氏曬小蜂體內(nèi)的Hsp60的表達。在低溫脅迫的情況下，隨著溫度的 不斷降低，周氏曬小蜂體內(nèi)的Hsp60的相對表達量呈上升的趨勢，并且在-7°C時達到最大 表達量；在高溫脅迫的情況下，隨著溫度的不斷升高，周氏曬小峰體內(nèi)的Hsp60的相對表達 量也呈上升的趨勢，但在40°C時達到最大表達量。運對于W后在何種室外溫度下放飛白蛾 周氏曬小蜂防治美國白蛾具有重要意義。
【主權項】
1. 周氏嗤小蜂熱激蛋白Hsp60的核苷酸序列，該序列全長1716bp，含完整的開放閱讀 框，具有SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。2. 權利要求1所述的序列，其中所述核苷酸序列對應的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所 示；該序列編碼571個氨基酸，分子量為60. 7KDa，等電點為5. 44。3.權利要求1所述周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp60的核苷酸序列在用于檢測防治美國白蛾 方面的應用。4.權利要求3所述的應用，其中所述防治美國白蛾指的是：Hsp60基因表達受溫度調(diào) 控，通過檢測Hsp60基因的表達情況，可以得知周氏嚙小蜂對于溫度脅迫的耐受情況，在低 于周氏嚙小蜂承受極限溫度下釋放小蜂，可以更好的起到防治美國白蛾的目的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了周氏嚙小蜂熱激蛋白Hsp60的cDNA全長序列及應用，該序列全長1716bp，含完整的開放閱讀框，編碼571個氨基酸。通過實時熒光定量PCR方法，研究不同溫度下白蛾周氏嚙小蜂Hsp60基因表達的變化，結(jié)果表明，高溫和低溫脅迫都會誘導周氏嚙小蜂Hsp60表達量增高，在40℃和-7℃時表達量最大。本發(fā)明可為科學利用天敵昆蟲周氏嚙小蜂進行生態(tài)防治提供分子基礎。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/12
【公開號】CN105296495
【申請?zhí)枴緾N201510837948
【發(fā)明人】李敏, 張新玥, 王鳳竹, 李婷婷, 朱耿平, 劉強
【申請人】天津師范大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月26日