瓜上10種病害的微陣列芯片檢測(cè)方法及所用芯片探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物病害檢測(cè)領(lǐng)域，特別是瓜上10種病害的微陣列芯片檢測(cè)方法及 所用芯片探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，植物病害的檢測(cè)技術(shù)由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)展到現(xiàn) 在的分子檢測(cè)水平，從檢測(cè)的速度、靈敏度準(zhǔn)確性等各個(gè)方面都有很大的進(jìn)步。血清學(xué)檢 測(cè)、普通PCR檢測(cè)技術(shù)、熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用使得病害的檢測(cè)在靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性 上更進(jìn)一步，但這類檢測(cè)技術(shù)已不能完全滿足大量、快速、靈敏對(duì)植物病害檢測(cè)的要求，基 因芯片技術(shù)的出現(xiàn)，將樣品檢測(cè)和分析過(guò)程實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、集成化和微型化，且具有高通量、 高靈敏度檢測(cè)水平，能夠同時(shí)對(duì)多種樣品中多種病原進(jìn)行檢測(cè)。
[0003] 基因芯片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期以來(lái)快速發(fā)展起來(lái)的分子生物學(xué)高新技術(shù)， 是各學(xué)科交叉綜合的嶄新科學(xué)。其原理是將大量DNA探針片段有序地固化于支持物的表 面，然后與已標(biāo)記的生物樣品中DNA分子雜交，再對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)分析。它是一種快 速、高效、高通量分析生物信息的工具。基因芯片在核酸序列測(cè)定、基因突變的檢測(cè)、基因表 達(dá)情況的分析、疾病診斷、病原菌檢測(cè)、藥物開(kāi)發(fā)和篩選等諸多領(lǐng)域的研究中得到了廣泛應(yīng) 用，受到人們的普遍重視。當(dāng)前隨著經(jīng)濟(jì)全球化和世界貿(mào)易量的持續(xù)增長(zhǎng)，一些病原微生物 也開(kāi)始快速流行。
[0004] 瓜類是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著我國(guó)近年來(lái)對(duì)外貿(mào)易的快速發(fā)展，瓜類種子進(jìn) 口量逐步上升，有害生物隨進(jìn)境瓜類種子傳入我國(guó)的可能性加大。在引種的過(guò)程中加強(qiáng)對(duì) 病原物的檢疫，防止疫病傳播蔓延是我們的重要工作之一。因此建立快速、高效、靈敏、特異 的檢測(cè)方法對(duì)加強(qiáng)進(jìn)出口瓜類種子檢疫有十分重要的意義。
[0005] 甜瓜黑點(diǎn)根腐病菌（MonosporascuscannonballusP.)、瓜蔓枯病菌 (MycosphaerellamelonisC·)、瓜炭疽?。–olletotrichumorbiculare)、黃瓜黑星病 菌（Cladosporiumcucumerinum)、黃瓜黑色根腐病菌（Phomopsissclerotioides)這類 真菌，瓜細(xì)菌性果斑病菌（Acidovoraxavenaesubsp.CitrulliW.)、瓜細(xì)菌性角斑病菌 (Psendomonassyringaepv.lachrymans)這類細(xì)菌以及南瓜花葉病毒（Sqashmosaic virus)、黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus)、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumbergreen mottlemosaicvirus)這類病毒是危害瓜類的重要病原物。在新疆局瓜種子出口貿(mào)易中， 這10種病害每年都有上百批的的檢測(cè)需求，在面對(duì)大量檢測(cè)樣品時(shí)，尤其在同一樣品要求 檢測(cè)多種病害的情況下，難以實(shí)現(xiàn)高通量快速同步多病害檢測(cè)，尤其是真菌、細(xì)菌病害分離 周期非常長(zhǎng)，經(jīng)驗(yàn)要求很高，陽(yáng)性樣品確定難度大，靈敏度不高，極大的影響了最終的檢測(cè) 結(jié)果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種瓜上10種病害的微陣列芯片檢測(cè)方法及所 用芯片探針，本發(fā)明能實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)檢疫準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、高通量的技術(shù)要求。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種瓜上10種病害的微陣列芯片，該芯片包 含如下寡核苷酸探針中的至少一類（涉及瓜炭疽病菌時(shí)，瓜炭疽病菌Τ-GAPDHx、瓜炭疽病 菌T-GSx必須同時(shí)使用）；
[0018]黃瓜綠斑駁花葉病毒Cgmmv-Px:GGAGGTTTAGAATGCCGCTTACCACGACCAC。
[0019] 本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述芯片進(jìn)行的瓜上10種病害的微陣列芯片檢測(cè)方 法，對(duì)每個(gè)待測(cè)樣品依次進(jìn)行以下步驟：
[0020] 1)、提取待測(cè)樣品的DNA;配置成濃度為5_20ng/μ1作為模板；
[0021] 2)、引物熒光標(biāo)記PCR反應(yīng)：
[0022] 反應(yīng)體系 25μ1 :10XPCRBuffer2. 5μl，25mMMgCl2 2. 5μ1，dNTP0· 5μ1， 1(^1上下游引物各0.54 1，51]/^1丁&9〇嫩聚合酶0.2以1，模板1.(^1;
[0023]PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 94°C5min;94°C30s，55°C30s，72°C30s，共 35 個(gè)循環(huán)；最 后 72°C延伸lOmin;
[0024] 上下游引物分別為以下（每種病菌對(duì)應(yīng)一套引物，即具體為：瓜炭疽病菌對(duì)應(yīng)2對(duì) 引物，其余病菌對(duì)應(yīng)1對(duì)引物）：
[0025] 瓜蔓枯病菌Db-3x:CGTAAGTAGACCTCCACCAC
[0026] Db-5x：CAAGGGAAGCGTGTCAT；
[0027]甜瓜黑點(diǎn)根腐病菌Mc-lx:CATTAAAGAGTTATCCAACTCC
[0028]Mc-2x：ATGATAATTATTCAGAAGTGCC；
[0029]瓜炭疽病菌GAPDH-3x:CCCTTCATTGAGACCAAGT
[0030] GAPDH-4x：GTACTTGAGCATGTAGGCCT；
[0031]瓜炭疽病菌GS-3x:TTCGTTCTCGAACACGAT;
[0032]GS-4x：GAGACATGACGACCTTGTTC；
[0033]瓜細(xì)菌性果斑病菌aac-lx:CTGGGAGCGATCTTCATC
[0034] aac-2x：GTCAGGAGGGTGAGTAGCA；
[0035]黃瓜黑色根腐病菌Phs-lx:CAACCACTCCCTCCCTT;
[0036] Phs-2x：GGCGGCTGTGTACAAGA；
[0037]黃瓜黑星病菌Cc-3x:ATCGAGAAGTTCGAGAAGG;
[0038] Cc-4x：GTGATACCACGCTCACG；
[0039]瓜細(xì)菌性角斑病菌Psl-lx:GGCGACGCAATCAATGAT;
[0040]Psl-2x：TTCTTCGGCGGTGGTTT；
[0041]黃瓜花葉病毒CMV-lx:TCCGAGGAATTAAATGTTGA;
[0042]CMV-2x：TCGCGTCACAGATGTCTAC；
[0043]南瓜花葉病毒SqMV-lx:ACTTTGAAGTGGCTGGAAA;
[0044]SqMV-2x：AGGCTTCTAAAGCGAACTG；
[0045]黃瓜綠斑駁花葉病毒Cgmmv-lx:CAGTTATAGGTCTAGGTCGCAG;
[0046]Cgmmv-2x：GAACATAAGAAGCACTAAACGC；
[0047] 備注：上游引物標(biāo)記Cy3;
[0048]3)、將步驟2)所得的至少2種病菌對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合；
[0049] 備注說(shuō)明：假設(shè)當(dāng)為瓜炭疽病菌和另一種病菌時(shí)，共獲得3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將此 3種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1:1:1的體積比進(jìn)行等體積混合；其余依次類推；
[0050] 4)、芯片雜交與洗滌：
[0051] 將步驟2)所得的每種病菌對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物（備注說(shuō)明：當(dāng)為瓜炭疽病菌時(shí)， 由于其有對(duì)應(yīng)2對(duì)引物，因此，需要將2對(duì)引物所對(duì)應(yīng)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物等體積混合；其余病 菌，均只有一種PCR擴(kuò)增產(chǎn)物）或者將步驟3)所得的混合物95°C變性5min，然后冰浴5min; 得預(yù)處理后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0052] 然后將上述預(yù)處理后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行芯片雜交與洗滌；所述芯片雜交為45°C雜 交lh;
[0053] 5)、芯片掃描，獲得檢測(cè)結(jié)果。
[0054] 作為本發(fā)明的瓜上10種病害的微陣列芯片檢測(cè)方法的改進(jìn)：
[0055] 步驟5)為：
[0056] 以每條探針重復(fù)點(diǎn)的均值計(jì)算信號(hào)強(qiáng)度值；若肉眼觀察有信號(hào)，信號(hào)絕對(duì)值大于 500,信噪比大于3,判為陽(yáng)性；若信號(hào)絕對(duì)值小于500,信噪比小于2,判為陰性；如果信號(hào)模 糊，信噪比介于2和3之間，判為可疑，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。
[0057] 作為本發(fā)明的瓜上10種病害的微陣列芯片檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0058] 步驟4)中，芯片雜交時(shí)所配制的雜交反應(yīng)液為：6μ1預(yù)處理后PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 300ηΜ雜交陽(yáng)性對(duì)照1μ1與7μ1雜交液充分混合；
[0059]所述雜交液為：2· 5 % 甲酰胺，2XSSC/4XSSC/6XSSC/8XSSC/10XSSC(優(yōu)選 6XSSC)0. 2%SDS〇
[0060] 舉例備注說(shuō)明：2. 5%甲酰胺，2XSSC，0. 2%SDS，即為：在100ml的2XSSC中加入 2. 5g甲酰胺和0. 2gSDS(十二烷基硫酸鈉）。
[0061] 為了滿足我國(guó)當(dāng)前對(duì)瓜類上病原物高通量檢測(cè)方法的迫切需要，有效控制瓜類上 病原物的發(fā)生和促進(jìn)瓜類進(jìn)出口貿(mào)易的發(fā)展，設(shè)計(jì)了本發(fā)明所述的瓜上10種病害的微陣 列芯片檢測(cè)方法及所用芯片探針。本發(fā)明符合檢驗(yàn)檢疫準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便、高通量的技術(shù)要 求，從接收樣品算起，一次性檢測(cè)10種病原物，總耗時(shí)不超過(guò)1天，大大縮短不同病原物的 鑒定過(guò)程，這對(duì)于有效控制病原物的入侵、蔓延起關(guān)鍵作用，為控制疫病疫情、加快口岸驗(yàn) 放速度贏得寶貴的時(shí)間。
[0062] 本發(fā)明首次對(duì)瓜類植物上的十種病害進(jìn)行了基因芯片檢測(cè)技術(shù)的探索，從而建立 一種可直接對(duì)這十種病害進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)的新方法，同時(shí)為基因芯片技術(shù)能夠更廣泛地應(yīng)用 于其他病害研究打下基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0063] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0064] 圖1為引物熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增結(jié)果圖；
[0065]_h：1.DL2000Marker；2.Cladosporiumcucumerinum-1 ；3.Cladosporium cucumerinum-2 ；4.Cladosporiumcucumerinum-3 ；5.Acidovoraxavenaesubsp. citrulli-1 ；6.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-2 ；7.Acidovoraxavenaesubsp. citrulli-3 ；8.Acidovoraxavenaesubsp.citrulli-4 ；9.Acidovoraxavenae subsp.citrulli-5 ；10.Colletotrichumorbiculare-1 (GAPDH) ；11.Colletotrichum orbiculare-2(GAPDH) ；12.Colletotrichumorbiculare-3(GAPDH) ；13.Colletotrichum orbiculare-4(GAPDH) ；14.Colletotrichumorbiculare-1 (GS) ；15.Colletotrichum orbiculare-2 (GS) ；16.Colletotrichumorbiculare-3 (GS) ；17.Colletotrichum orbiculare-4 (GS) ；18.Didymellabryoniae-1 ；19.Didymellabryoniae-2 ；20.Didymella bryoniae-3?21.Didymellabryoniae-4 ；22.DL2000Marker
[0066] 下：1.DL2000MarkerMonosporascuscannonballus-1 ；3.Monosporascus cannonballus-2 ；4.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-1 ；5.Cucumbergreen mottlemosaicvirus-2 ；6.Cucumbergreenmottlemosaicvirus-3 ；7.Phomopsis sclerotioides-1 ；8.Phomopsissclerotioides-2 ；10.Squashmosaicvirus-1 ； 11.Squashmosaicvirus-2 ；12.Squashmosaicvirus-3 ； 13.Psendomonassyringae pv.lachrymans-1 ；14.Psendomonassyringaepv.lachrymans-2 ；15.Psendomonas syringaepv.lachrymans-3 ；16.Cucumbermosaicvirus-1 ；17.Cucumbermosaic virus-2 ；18.Cucumbermosaicvirus-3 ；19.DL2000Marker
[0067] 圖2為芯片雜交前預(yù)掃描結(jié)果。