一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫杉醇最早從短枝紅豆杉（Taxusbreviifolia)的樹(shù)皮中分離得到，命名為紫杉 醇。紫杉醇隨后被證實(shí)具有獨(dú)特的抗癌機(jī)制，由于其獨(dú)特的抗癌機(jī)制，對(duì)于普通抗癌藥物 無(wú)能為力的某些晚期腫瘤均有良好療效，并且對(duì)于多種臨床惡性腫瘤療效突出，完全不同 于以往上市的任何一種抗癌藥。美國(guó)食品與藥物管理局（FDA)于1992年12月正式批準(zhǔn)紫 杉醇用于臨床。
[0003] 由于紅豆杉已經(jīng)作為瀕危物種被列為國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物，顯然從紅豆杉植物組織 中提取紫杉醇已受到極大的限制，同時(shí)紅豆杉樹(shù)皮中紫杉醇含量很低，藥源極其有限，遠(yuǎn)不 能滿(mǎn)足臨床用藥需要。紅豆杉細(xì)胞組織培養(yǎng)需要的條件嚴(yán)格且產(chǎn)量低而化學(xué)合成成本昂 貴，因此這兩種途徑均不適合大量獲取紫杉醇。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)紫杉醇，它是不需依賴(lài) 紅豆杉而極具工業(yè)化生產(chǎn)潛力的方法，但是通過(guò)目前所具有的方法篩選出來(lái)的紫杉醇菌產(chǎn) 紫杉醇的含量低，并不能滿(mǎn)足工業(yè)要求。因此，尋求一種從紅豆杉分離到產(chǎn)紫杉醇效率高的 內(nèi)生真菌，將會(huì)為紫杉醇的微生物工程提供一條更廣闊的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種從紅豆杉分離到產(chǎn)紫杉醇效率 高的內(nèi)生真菌的方法。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明提供了一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，包括如下步驟：
[0007] 1)對(duì)紅豆杉植物的組織進(jìn)行培養(yǎng)，分離純化獲得內(nèi)生真菌；
[0008] 2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對(duì)發(fā)酵代謝物進(jìn)行初篩，篩出可 產(chǎn)紫杉醇或其類(lèi)似物的菌株；
[0009] 3)結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定出代謝物對(duì)CH0細(xì)胞的抑制率；
[0010] 4)利用高效液相色譜做進(jìn)一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。
[0011] 上述的從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的步驟，優(yōu)選為：
[0012] 1)對(duì)紅豆杉植物的組織消毒后在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)數(shù)天到數(shù)十天，分離純化 獲得內(nèi)生真菌，并做空白對(duì)照試驗(yàn)排除空氣中真菌；
[0013] 2)液體培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對(duì)這些內(nèi)生真菌的發(fā)酵代 謝物進(jìn)行初篩，篩出可產(chǎn)紫杉醇或其類(lèi)似物的菌株；
[0014] 3)結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，用Resazurin法檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率，對(duì)經(jīng)初步篩選出的次生 代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，測(cè)定出代謝物對(duì)CH0細(xì)胞的抑制率；
[0015] 4)通過(guò)高效液相色譜做進(jìn)一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。
[0016] 上述的紅豆杉植物的組織是樹(shù)皮、樹(shù)葉或果實(shí)。
[0017] 本發(fā)明的另一目的在于提供通過(guò)上述方法獲得的產(chǎn)紫杉醇菌株。
[0018] 上述產(chǎn)紫杉醇菌株已于2014年5月26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心（地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)）保藏號(hào)為CGMCC No. 9251。 該保藏的生物材料的分類(lèi)命名為：木霉（Trichoderma sp.)。
[0019] 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有上述產(chǎn)紫杉醇菌株的生物制劑。
[0020] 本發(fā)明提供的篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，可根據(jù)內(nèi)生真菌培養(yǎng)的需要調(diào)整固體培養(yǎng) 基的營(yíng)養(yǎng)成分和最佳的內(nèi)生真菌生長(zhǎng)環(huán)境條件，盡可能多培養(yǎng)出產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌。同 時(shí)做了空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，排除空氣中的真菌的干擾影響。然后通過(guò)TLC和HPLC檢測(cè)并結(jié)合腫 瘤模型實(shí)驗(yàn)篩選來(lái)確定產(chǎn)紫杉醇菌，能盡快使從真菌發(fā)酵途徑獲取紫杉醇擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)提供有 價(jià)值的實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)。因此，本發(fā)明提供的從黃山地區(qū)紅豆杉果實(shí)中培養(yǎng)并篩選產(chǎn)紫杉醇 菌的技術(shù)是高效、操作簡(jiǎn)單和切實(shí)可行的方法。該方法篩選產(chǎn)紫杉醇菌用于微生物培養(yǎng)獲 得紫杉醇的含量大大增加，為微生物工程提供了更廣闊的途徑。
[0021] 可見(jiàn)，將本發(fā)明提供的方法對(duì)我國(guó)這些珍稀藥用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行的研究和開(kāi) 發(fā)，對(duì)于開(kāi)發(fā)我國(guó)植物內(nèi)生真菌的藥用資源以及瀕危藥用植物的生態(tài)保護(hù)等均具有重要的 理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0022] 圖1為薄層層析對(duì)這些內(nèi)生真菌的發(fā)酵代謝物進(jìn)行分析的初篩圖。
[0023] 圖2為紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜。
[0024] 圖3為HQ-24代謝物的HPLC圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本 發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的修飾或者替換，均屬于本發(fā)明的范疇。
[0026] 實(shí)施例
[0027] 將新鮮的黃山地區(qū)紅豆杉果實(shí)切成1cm2小塊。把果實(shí)浸泡于75%酒精5min左右， 接種于如下平板培養(yǎng)基中：馬鈴薯20gL \葡萄糖20gL \瓊脂20gL 1和葡萄糖40gL \蛋白 胨10gL \酵母浸出粉10gL \瓊脂20gL \在25°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8天。待菌落從切口處長(zhǎng)出 后，觀察培養(yǎng)皿中材料切口處長(zhǎng)出菌絲（菌落），挑取切口處菌絲尖端轉(zhuǎn)接到新的平板培養(yǎng) 基上培養(yǎng)，待長(zhǎng)成菌落后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，分別挑取其邊緣 的菌絲進(jìn)行分離培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)及其菌落邊緣的整齊情況，并做相應(yīng)記錄。采用菌絲 頂端純化法如此反復(fù)純化后，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基上，于28 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d后，對(duì)菌株進(jìn) 行編號(hào)，并放入4°C冰箱保存。將分離純化后得到的菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)，25°C，轉(zhuǎn)速為120r/ min搖床中培養(yǎng)10d。將培養(yǎng)好的發(fā)酵液抽濾，分離出發(fā)酵液。發(fā)酵液采用低溫真空濃縮處 理，濃縮至原體積的1/5后用等體積的乙醚和乙酸乙酯萃取多次后，將有機(jī)相濃縮近于lml 備用。
[0028] 用紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為對(duì)照，樣品用毛細(xì)管在GF254高效薄層硅膠板點(diǎn)樣，點(diǎn) 樣后放入層析缸中展開(kāi)，層析后取出硅膠板，在薄層板上噴顯色劑，再觀察斑點(diǎn)的位置和顏 色，結(jié)果見(jiàn)圖1，通過(guò)該圖可發(fā)現(xiàn)共有8個(gè)菌株（分別為HQ-2、HQ-5、HQ-41、HQ-67、HQ-24、 HQ-40、HQ-69、HQ-71)的發(fā)酵液提取物在薄層板上均能產(chǎn)生紫杉醇的特征性斑點(diǎn)出現(xiàn)，根據(jù) 原點(diǎn)至主斑點(diǎn)中心及展開(kāi)劑前沿的距離，計(jì)算比移值（Rf)，其比移值Rf均與紫杉醇的標(biāo)準(zhǔn) 品相同。對(duì)經(jīng)TLC篩選出的8株經(jīng)醇沉處理的篩選出紅豆杉內(nèi)生真菌菌株發(fā)酵液凍干品用 12. 5%的DMSO配成1. Omg/ml的樣品溶液，用CHO Cytotoxicity Assay模型進(jìn)行測(cè)定，樣 品的測(cè)試終濃度為100 μ g/ml。對(duì)經(jīng)上述篩選出的代謝產(chǎn)物進(jìn)行體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，于 37°C、5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h。酶標(biāo)儀檢測(cè)，測(cè)定出代謝物對(duì)CH0細(xì)胞的抑制率。測(cè)定結(jié) 果見(jiàn)表1，表明8株菌株的代謝物對(duì)CH0細(xì)胞的抑制率均較大，可見(jiàn)該菌株的代謝物細(xì)胞毒 活性較大。其中HQ-24的代謝物對(duì)CH0細(xì)胞的抑制率達(dá)到70%以上，該菌株的代謝物細(xì)胞 毒活性最大。
[0029] 表1 8株紅豆杉內(nèi)生真菌代謝物對(duì)CH0細(xì)胞的細(xì)胞毒性
[0031] 再通過(guò)高效液相色譜對(duì)抑制率較高發(fā)酵物（HQ-24)做了進(jìn)一步分析，利用HPLC建 立紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3,結(jié)果發(fā)現(xiàn)HQ-24菌株發(fā)酵代謝物的吸收峰與紫杉醇 標(biāo)準(zhǔn)品吸收峰保留時(shí)間一致，可確定該菌為產(chǎn)紫杉醇菌?？梢?jiàn)，其他樣品也均為產(chǎn)紫杉醇 菌，最后對(duì)產(chǎn)紫杉醇菌進(jìn)行鑒定，屬于木霉（Trichoderma sp.)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，其特征是，包括如下步驟： 1) 對(duì)紅豆杉植物的組織進(jìn)行培養(yǎng)，分離純化獲得內(nèi)生真菌； 2) 培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對(duì)發(fā)酵代謝物進(jìn)行初篩，篩出可產(chǎn)紫 杉醇或其類(lèi)似物的菌株； 3) 結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定出代謝物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率； 4) 利用高效液相色譜做進(jìn)一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，其特征是，包括如 下步驟： 1) 對(duì)紅豆杉植物的組織消毒后在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)數(shù)天到數(shù)十天，分離純化獲得 內(nèi)生真菌，并做空白對(duì)照試驗(yàn)排除空氣中真菌； 2) 液體培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對(duì)這些內(nèi)生真菌的發(fā)酵代謝物 進(jìn)行初篩，篩出可產(chǎn)紫杉醇或其類(lèi)似物的菌株； 3) 結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，用Resazurin法檢測(cè)生長(zhǎng)抑制率，對(duì)經(jīng)初步篩選出的次生代謝 產(chǎn)物進(jìn)行體外抗腫瘤活性試驗(yàn)，測(cè)定出代謝物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率； 4) 通過(guò)高效液相色譜做進(jìn)一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法，其特征是，所述 紅豆杉植物的組織是樹(shù)皮、樹(shù)葉或果實(shí)。4. 通過(guò)權(quán)利要求1所述的方法所獲得的產(chǎn)紫衫醇菌株。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的產(chǎn)紫衫醇菌株，其保藏號(hào)為CGMCCNo. 9251。6. 含有權(quán)利要求4或5所述的產(chǎn)紫衫醇菌株的生物制劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種從紅豆杉中培養(yǎng)篩選產(chǎn)紫杉醇菌的方法。本發(fā)明的方法包括以下步驟：1)對(duì)紅豆杉植物的組織進(jìn)行培養(yǎng)，分離純化獲得內(nèi)生真菌；2)培養(yǎng)步驟1)中獲得的內(nèi)生真菌，利用薄層層析對(duì)發(fā)酵代謝物進(jìn)行初篩，篩出可產(chǎn)紫杉醇或其類(lèi)似物的菌株；3)結(jié)合細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)，測(cè)定出代謝物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率；4)利用高效液相色譜對(duì)其作了進(jìn)一步分析，確定產(chǎn)紫杉醇菌株。本發(fā)明提供的從紅豆杉分離產(chǎn)紫杉醇的方法過(guò)程簡(jiǎn)單，成本較低。并且通過(guò)本發(fā)明提供的方法提取得到的產(chǎn)紫杉醇菌用于微生物培養(yǎng)時(shí)，獲得紫杉醇的含量大大增加，該方法為微生物工程提供了更廣闊的途徑。CGMCC No925120140526
【IPC分類(lèi)】C12N1/14, C12R1/885
【公開(kāi)號(hào)】CN105316238
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410300629
【發(fā)明人】汪友明, 樊美珍, 馬忠友, 胡豐林, 張袖麗, 田超, 陸瑞利
【申請(qǐng)人】安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2014年6月25日