一種基于HMGR 3’-UTR和rRNA ITS的引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明專利涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種基于HMGR 3' -UTR和rRNA ITS的引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（HMGR)催化3-羥基-3-甲基戊二單酰輔酶A 生成甲羥戊酸，HMGR是刺五加苷生物合成中的限速酶。刺五加苷是五加皮和刺五加的有效 成分，也是品種鑒別和質(zhì)量鑒定的目標(biāo)化合物。mRNA 3'端非編碼區(qū)（3'-UTR)是mRNA編 碼區(qū)末端的終止密碼子延伸至多聚A尾巴（Poly-A)的前端的一段核苷酸序列。真核生物 的3' -UTR在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用，可調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性、控制其翻譯、協(xié)助辨認(rèn) 密碼子等，3'-UTR在不同基因和不同物種中間具有高度特異性，還可以作為分子標(biāo)記，特別 是植物的次生代謝相關(guān)酶。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS)是rDNA中18S rRNA基因和28S rRNA基 因之間的序列。rDNA上的5.8S、18S和28S rRNA基因有極大的保守性，即存在著廣泛的異 種同源性。而ITS區(qū)不加入成熟核糖體，所以ITS片段在進(jìn)化過(guò)程中承受的自然選擇壓力 非常小，因此能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài) 性，即使是親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異。研究表明，ITS片段 的進(jìn)化速率是18S rDNA的10倍。這就是ITS序列應(yīng)用在中藥材鑒定分析中的理論基礎(chǔ)。
[0003] 五加皮系五加科植物細(xì)柱五加的干燥根皮，為常用中藥。又名白刺、目骨、追風(fēng)使、 南五加皮等。該植物主要分布于湖北，河北，安徽，四川等地。五加皮性溫，味辛、苦，歸肝、 腎經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、通游血、利水腫、鎮(zhèn)痛解熱等功效，臨床主要用于治療風(fēng) 濕瘦痛、腰膝軟弱、小兒行遲、跌打，骨折等病癥，為常用的重要中藥材之一?，F(xiàn)代研究證明 本品還具有抗腫瘤、抗疲勞、降低全血粘度、防止動(dòng)脈粥樣硬化形成等作用。
[0004] 香加皮亦稱北五加皮，來(lái)源于蘿蘑科植物杠柳的干燥根皮，為常用傳統(tǒng)中藥。本品 性溫，味辛苦，有毒，歸肝、腎、心經(jīng)。有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的功效。用于風(fēng)寒濕痹，腰膝酸軟， 心悸氣短，下肢浮腫。主產(chǎn)于甘肅、陜西、河南、山西等地。與五加皮藥理作用有異，藥物功 效也不相同，五加皮有補(bǔ)肺腎、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)除濕的功效；香加皮雖也有柱風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨的功 效，但與五加皮作用機(jī)制不同。香加皮中含有杠柳毒苗，它有劇烈的強(qiáng)心作用但同時(shí)又為毒 性成分，過(guò)量服用甚至?xí)?dǎo)致死亡。2010版《中國(guó)藥典》一部五加皮項(xiàng)下僅規(guī)定了性狀、顯 微鑒別、水分、總灰分等檢查項(xiàng)，不能準(zhǔn)確鑒別，因此應(yīng)用分子標(biāo)記和基因工程技術(shù)鑒定五 加皮和香加皮能夠精確的辨別、鑒定，避免混淆。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] -、引物序列 本發(fā)明提供了一種基于HMGR 3'-UTR和rRNA ITS的引物及其應(yīng)用。用于鑒定的引物 為： 1、基于五加皮 HMGR 3'_UTR 的引物：上游 FI :5'_ggcatcatgtactaggatacagtcg_3' ，下游 F2 :5'_ catagtcagactgaatgtaatctgtctac-3' 2、 基于五加皮 rRNA ITS 的引物：上游 F3 :5'_cacgacgtgtgcacgactctagtacg_3' ，下游 F4 :5'_ctgcgtcgctatacgagacgatgccac_3' 3、 基于香加皮 rRNA ITS 的引物：上游 F5 :5'_cggactagtgcgagtatcgtcgcag_3' ，下游 F6 :5'_ggcatgcactcagcagtgaatgcacg_3' 采用DNA合成儀對(duì)上述引物進(jìn)行合成，即得到鑒定引物的白色晶體。
[0006] 上述引物序列經(jīng)NCBI的nucleotide blast比對(duì)后Max score均不超過(guò)41，Query cover均不超過(guò)75%，并且在公布的五加科植物中未檢出Query cover超過(guò)50%的序列，說(shuō) 明引物序列特異性高；最大Max score和Query cover數(shù)據(jù)如下：
二、引物序列獲得的方法 1、同源序列的獲得和同源引物設(shè)計(jì) 通過(guò)NCBI進(jìn)行檢索，分別獲得刺五加（注冊(cè)號(hào)JQ905593)、擬南芥(注冊(cè)號(hào)： AY488113)、三七（注冊(cè)號(hào)：KP702301)、人參（注冊(cè)號(hào)：⑶565098)、西洋參（注冊(cè)號(hào)： FJ755158HMGR)的HMGR序列并在NCBI上應(yīng)用blast進(jìn)行同源序列分析，再采用Clustal X 軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，根據(jù)HMGR 0RF區(qū)的保守區(qū)設(shè)計(jì)HMGR同源PCR引物（HMGR引 物序列：上游 Fa :5'_agtaaattcagggggagtcata_3' 和下游 Fb :5'_caccattttcaactttaactgg tg-3'），該引物在后續(xù)五加皮DNA樣品PCR中驗(yàn)證能夠擴(kuò)增得到DNA片段，說(shuō)明PCR引物在 五加皮同樣具有保守性。18S rRNA在不同物種間具有高度保守性，通過(guò)NCBI進(jìn)行檢索，分 別獲得刺五加（注冊(cè)號(hào)：AB080245)、擬南芥（注冊(cè)號(hào)：X16077)、三七(注冊(cè)號(hào)：AB027525)、人 參(注冊(cè)號(hào)：D83275)、西洋參(注冊(cè)號(hào)：D85172)18S rRNA基因序列，并在NCBI上應(yīng)用blast 進(jìn)行同源序列分析，再采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列同源性比對(duì)，根據(jù)18S rRNA的保守 區(qū)設(shè)計(jì)同源 PCR 引物（18S rRNA 引物：上游 Fc :5' -ggtcgacgcgggctctggct-3' 和下游 Fd : 5'-gcggttcgccgccggcgacgtcg-3'），該引物在后續(xù)五加皮和香加皮DNA樣品PCR中驗(yàn)證能夠 擴(kuò)增得到DNA片段，說(shuō)明PCR引物在五加皮同樣具有保守性。
[0007] 2、樣品總RNA提取 分別取五加皮和香加皮鮮根組織100 mg置于研缽中，加入1.0 mL Trizol充分研磨， 研磨過(guò)程中不斷加入液氮。將勻漿移入1.5 mL EP管，冰浴5分鐘。每管加入0.2 mL氯仿， 震蕩15 s，冰浴2~3 min。12000 r/min，4°C離心5 min，吸取上清液移入1.5 mL新EP管 中，加入0. 5 mL異丙醇，輕輕地上下顛倒混勾，冰浴10 mirul^OOO r/min，4°C離心5 min， 棄去上清液，加1 mL 75% DEPC水配制的乙醇，震蕩拍勻使RNA沉淀重新懸浮。12000 r/ min，4°C離心5 min，緩慢傾倒EP管棄去上清液，超凈工作臺(tái)下EP管倒置于無(wú)菌吸水紙上， 自然干燥30 min，加入0. 1% DEPC水20~50 μ L混勻、溶解RNA，-80°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0008] 3、總 RNA 檢測(cè) 取瓊脂糖粉末80 g和l.OXTAE 80 mL置于三角燒杯中，然后放于微波爐中緩慢加熱， 直至瓊脂糖粉末完全溶于TAE溶液中呈現(xiàn)透明液體狀態(tài)，取出燒杯，自然冷卻至50°C ~60°C 之間時(shí)，加入極少量的EB，輕輕搖動(dòng)燒杯使其混勻溶解，再沿著凝膠槽邊緩緩倒入已插入梳 子的凝膠槽，等待10~20min后完全冷卻凝固后，拔出梳子。
[0009] 取RNA樣品5 μ L和1 μ L Lording buffer混合均勾后加入凝膠塊樣品孔，置于 電泳槽中80 V電泳1.5 h，取出凝膠塊置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察RNA分離情況。另取5 μ L RNA樣品溶解于690 yL蒸餾水中，混勻，紫外分光光度計(jì)中測(cè)定0D值。取RNA樣品0D26。/ 0D2SM>1. 8進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。
[0010] 4、3' -RACE 擴(kuò)增獲取 0RF 下游 UTR 和 ITS (1) 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈 在100μLPCR管中建立3'-RACEcDNA第一鏈合成體系（如下表)，其中3'-CDS引物為 試劑盒所帶引物：
將以上反應(yīng)體系混勻，70°C水浴120s后，冰浴120s，迅速離心后分別加入下表的試劑。 混合各組分并離心，恒溫金屬浴中42°C反應(yīng)90 min，每管中加入0. lmL TE緩沖液稀釋反應(yīng) 體系，72 °C反應(yīng)7min，所得樣品-70 °C保存。
(2) RACE PCR 反應(yīng) 按照下表加入各成分，其中通用引物是與CDS配對(duì)的引物，3'-RACE的上游引物(試劑 盒所帶引物)，3' GSP為3' -RACE的下游引物，即為上述設(shè)計(jì)合成的引物Fa和Fb (或Fc和 Fd)。變性溫度94°C，退火溫度55°C，每循環(huán)一次溫度下降1°C，總共30循環(huán)。
5、PCR產(chǎn)物測(cè)序 采用高通量測(cè)序儀Hiseq 2500對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。五加皮HMGR樣品測(cè)序數(shù)據(jù)包括 部分ORF和全部3'-UTR序列。五加皮和香加皮18s rRNA樣品測(cè)序數(shù)據(jù)包括部分18s rRNA 序列和3'下游部分ITS序列。測(cè)序所得五加皮HMGR 3'-UTR序列如序列表SEQ ID NO. 1、 五加皮 rRNA ITS SEQ ID NO. 2、香加皮 rRNA ITS 的引物 SEQ ID NO. 3。
[0013] 6、引物設(shè)計(jì)及BLAST檢驗(yàn) 將測(cè)序數(shù)據(jù)利用NCBI的BLAST功能進(jìn)行序