標(biāo)準(zhǔn)曲線換算得到蝦青素的濃度。野生型對(duì)照 以及轉(zhuǎn)基因微藻的蝦青素濃度和含量示于表6。
[0145] 表6轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照蛋白核小球藻中蝦青素濃度和含量
[0147] 表6的結(jié)果表明HpBKT-HpCHYB轉(zhuǎn)基因的微藻BC9-1中，蝦青素的含量遠(yuǎn)高于野生 型對(duì)照和HpBKT轉(zhuǎn)基因的微藻B7-7。因此，使用BKT和CHYB轉(zhuǎn)基因可以在微藻中大量生產(chǎn) 蝦青素。
[0148] 以上結(jié)合附圖示例性地說明了本申請(qǐng)的各實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本說明書 公開的內(nèi)容可以很容易地想到，可以根據(jù)實(shí)際需要對(duì)各實(shí)施例進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整和重新組合， 而不會(huì)脫離本申請(qǐng)的精神。本申請(qǐng)的保護(hù)范圍以本申請(qǐng)的權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
[0149] 參考文獻(xiàn)
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【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種微藻表達(dá)載體，其特征在于，所述微藻表達(dá)載體包含微藻的內(nèi)源性啟動(dòng)子，所 述內(nèi)源性啟動(dòng)子可以用于在微藻中控制表達(dá)蛋白，優(yōu)選所述微藻表達(dá)載體選自pGreen、 pGreen0000、pGreen0029、pBI121、pBIN19、pBI221、pCambial300、SpBlueScriptSK/KS* 列載體，所述微藻的內(nèi)源性啟動(dòng)子是內(nèi)源性熱激蛋白70啟動(dòng)子。2. -種微藻表達(dá)載體，其特征在于，所述微藻表達(dá)載體包含β-胡蘿卜素酮化酶基 因（ΒΚΤ)和β-胡蘿卜素羥化酶基因（CHYB)，優(yōu)選所述微藻表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、終止序 列和抗生素抗性基因，所述微藻表達(dá)載體選自pGreen、pGreenOOOO、pGreen0029、ρΒΙ121、 ρΒΙΝ19、ρΒΙ221、pCambial300、或pBlueScriptSK/KS系列載體，所述啟動(dòng)子是蛋白核小球 藻的內(nèi)源性熱激蛋白70啟動(dòng)子。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的微藻表達(dá)載體，其特征在于，所述微藻表達(dá)載體通過如下方 法構(gòu)建而得：將BKT基因插入到所述微藻表達(dá)載體中，得到包含BKT基因的微藻表達(dá)載體 (pBKT);用CHYB基因代替所述包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT)中的BKT基因片段，從 而得到包含CHYB基因的微藻表達(dá)載體（pCHYB)，再將所述載體上的啟動(dòng)子：：CHYB::終止序 列通過PCR擴(kuò)增和酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT)中，從而得到包含 BKT基因和CHYB基因的微藻表達(dá)載體。4. 一種包含如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的微藻表達(dá)載體的微藻。5. -種使用β-胡蘿卜素酮化酶（BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶（CHYB)在微藻中生產(chǎn) 蝦青素的方法。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括構(gòu)建包含BKT和CHYB的微 藻表達(dá)載體，將所述微藻表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到微藻中表達(dá)，其中所述微藻表達(dá)載體包含啟動(dòng)子、 終止序列和抗生素抗性基因，所述啟動(dòng)子是蛋白核小球藻的內(nèi)源性熱激蛋白70啟動(dòng)子。7. 根據(jù)權(quán)利要求5-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述微藻表達(dá)載體通過如下 方法構(gòu)建而得：將BKT基因插入到所述微藻表達(dá)載體中，得到包含BKT基因的微藻表達(dá)載體 (pBKT);用CHYB基因代替所述包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT)中的BKT基因片段，從 而得到包含CHYB基因的微藻表達(dá)載體（pCHYB)，再將所述載體上的啟動(dòng)子：：CHYB::終止序 列通過PCR擴(kuò)增和酶切后，插入到包含BKT基因的微藻表達(dá)載體（pBKT)中，從而得到包含 BKT基因和CHYB基因的微藻表達(dá)載體。8. 使用如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的微藻表達(dá)載體制備生產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因微藻 的方法，其特征在于，所述方法包括構(gòu)建如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的微藻表達(dá)載體，將 所述微藻表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到微藻中，使得BKT和CHYB基因在轉(zhuǎn)基因微藻中表達(dá)，并且催化所 述微藻本身的類胡蘿卜素生成蝦青素。9. 如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的微藻表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因微藻中的應(yīng)用，其特征 在于，所述應(yīng)用包括構(gòu)建如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的微藻表達(dá)載體，將所述微藻表達(dá) 載體轉(zhuǎn)化到微藻中，使用抗生素選擇性壓力下獲得生產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因藻株。10. 使用如權(quán)利要求2-3中任一項(xiàng)所述的微藻表達(dá)載體制備轉(zhuǎn)基因微藻的方法所制備 獲得的產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因微藻。11. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法獲取的轉(zhuǎn)基因微藻作為提取蝦青素的原材料的應(yīng)用。12. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法獲取的轉(zhuǎn)基因微藻在制備動(dòng)物養(yǎng)殖品、保健食品或化 妝品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本申請(qǐng)涉及微藻表達(dá)載體，以及使用β-胡蘿卜素酮化酶(β-carotene？ketolase，BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene？hydroxylase，CHYB)在轉(zhuǎn)基因微藻中生產(chǎn)蝦青素的方法。具體而言，本申請(qǐng)涉及構(gòu)建微藻表達(dá)載體，包含β-胡蘿卜素酮化酶基因(BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶基因(CHYB)的微藻表達(dá)載體，包含所述微藻表達(dá)載體的微藻，使用BKT和CHYB在微藻中生產(chǎn)蝦青素的方法，使用所述微藻表達(dá)載體制備生產(chǎn)蝦青素的轉(zhuǎn)基因微藻的方法，所述微藻表達(dá)載體在制備轉(zhuǎn)基因微藻中的應(yīng)用，以及所述微藻表達(dá)載體在生產(chǎn)蝦青素中的應(yīng)用。
【IPC分類】C12P23/00, C12N1/13, C12N15/79
【公開號(hào)】CN105316357
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510662484
【發(fā)明人】李元廣, 范建華, 房磊, 李淑蘭, 王軍
【申請(qǐng)人】華東理工大學(xué), 嘉興澤元生物制品有限責(zé)任公司
【公開日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日