一種提高微藻產(chǎn)油量的培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高微藻產(chǎn)油量的培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化石燃料是人類生產(chǎn)生活的主要能源，但隨著化石燃料的日趨枯竭，以及燃燒化石燃料導(dǎo)致的生態(tài)污染、氣候變暖等問題，使得可再生潔凈生物燃料及微藻等替代生物能源原料的研究與開發(fā)應(yīng)用成為熱點。較之前兩代生物原料，微藻具有生長周期短、繁殖迅速、光合效率高、抗逆性較好、不占用耕地、易于人工控制及連續(xù)培養(yǎng)，種類繁多，且有些種類自身產(chǎn)油量較高等特點，被認為是較為理想的生物能源原料。為了更好地利用微藻產(chǎn)油，提高其產(chǎn)油量，目前普遍認為有兩種途徑可供選擇:一是提高微藻生物量，即通過高密度培養(yǎng)，實現(xiàn)產(chǎn)油量的提高；二是提高微藻含油量，即通過缺氮培養(yǎng)提高單位藻細胞油脂積累量來實現(xiàn)。然而，該兩種方法在實際應(yīng)用時仍然存在局限性，例如高密度培養(yǎng)過程中，當微藻密度達到一定水平時，單位藻細胞光能利用率低、細胞間營養(yǎng)競爭激烈、細胞分裂能力降低，導(dǎo)致生長嚴重受限；缺氮培養(yǎng)需要一定起始接種量，且生長狀態(tài)較好的微藻，經(jīng)缺氮培養(yǎng)，微藻胞內(nèi)可利用氮源持續(xù)減少而逐漸積累油脂，該方法同樣需要較長的培養(yǎng)周期及相對較高的生產(chǎn)成本。因此，研究者們?nèi)灾铝τ趯ふ腋咝?、快速的提高微藻產(chǎn)油量的方法。
[0003]活性氧是生物生理代謝過程中產(chǎn)生的如超氧陰離子自由基(02.)、過氧化氫(H202)、羥基自由基(0H.)等一類含氧物質(zhì)的總稱。在植物體內(nèi)，H202被證實不僅參與調(diào)控植物正常生長發(fā)育過程，還能作為信號分子協(xié)調(diào)植物體內(nèi)的茉莉酸、水楊酸、乙烯等激素信號傳導(dǎo)途徑，在植物抗高光強、抗旱、抗冷、抗鹽和重金屬等脅迫反應(yīng)過程中發(fā)揮極其重要的作用。H202水溶液俗稱雙氧水，是一種無色透明液體，具強氧化性，其水溶液的稀釋液是被廣泛使用的殺菌消毒劑。外源H202水溶液處理能增強植物對干旱、低溫、金屬離子和鹽的耐受力。對微藻的研究表明，高光強脅迫能促進微藻細胞內(nèi)h202含量的增加，以及油脂和色素的積累。盡管已有研究表明，外源h202處理可以直接導(dǎo)致微藻積累油脂，但外源活性氧處理在提高單位細胞油脂積累量的同時，是否也能夠提高微藻的產(chǎn)油量？在微藻培養(yǎng)及微藻源生物柴油的生產(chǎn)過程中，是否可以通過在微藻培養(yǎng)基中添加過氧化氫來提高微藻的產(chǎn)油量？尚未有報道。要正確評估活性氧對微藻產(chǎn)油量的影響，微藻的生物量應(yīng)當被考慮在內(nèi)。其次，由于過量的活性氧會引起生物細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸和脂類的氧化損傷，甚至導(dǎo)致細胞死亡，所以單位藻細胞可以承受的活性氧的濃度范圍亦應(yīng)被考慮。因此，只有明確了活性氧的安全使用濃度范圍及其對微藻生物量的影響，對實際生產(chǎn)應(yīng)用才有指導(dǎo)意義。
[0004]常見規(guī)模培養(yǎng)的微藻包括，湛江等鞭金藻Isochrysis zhangjiangensis、微擬球藻Nannochloropsis oculata>ilf^^^^Nitzschia closterium、鹽生杜氏藻Dunaliellasalina等,在一定培養(yǎng)條件下均會積累油脂。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種高效、快速、綠色的提高微藻產(chǎn)油量的培養(yǎng)方法。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種提高微藻產(chǎn)油量的培養(yǎng)方法，在微藻培養(yǎng)基中添加雙氧水，使添加部分H202在培養(yǎng)基中的終濃度為0.35-12mM。
[0007]所述H202濃度范圍適用于細胞濃度在0.1-16.3X107cells/mL的微藻。
[0008]所述微藻為金藻、單細胞綠藻或硅藻。
[0009]所述微藻培養(yǎng)基含氮量為1.8-120mg/L,微藻細胞內(nèi)磷含量為68.9-202.5pg/L/cell,光照強度為 80-200 μ mol/(m2.s)。
[0010]本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于:
[0011](1)可在短時間內(nèi)促進微藻油脂的迅速積累，縮短培養(yǎng)周期，降低生產(chǎn)成本。
[0012](2)本發(fā)明用低濃度H202作為微藻油脂積累的誘導(dǎo)劑，H202使用劑量少、對環(huán)境友好、操作方便、效果明顯，適用于微藻產(chǎn)油規(guī)?；囵B(yǎng)。
【附圖說明】
[0013]圖1培養(yǎng)體系光照強度為180ymOl/(m2.s)，氮含量為1.8mg/L，細胞濃度為4.9X 107cells/mL，胞內(nèi)磷含量為68.9pg/L/cell的金藻經(jīng)過不同濃度H202處理8h后的細胞濃度、中性脂含量和相對產(chǎn)油量變化趨勢圖。
[0014]圖2培養(yǎng)體系光照強度為180ymOl/(m2.s)，氮含量為1.8mg/L，細胞濃度為4.9X107cells/mL，胞內(nèi)磷含量為68.9pg/L/cell的金藻經(jīng)過6mM H202處理前后的尼羅紅染色顯微圖片(注:圖中白色箭頭指向的白色亮點為儲油細胞器——油體)。
[0015]圖3培養(yǎng)體系光照強度為180ymOl/(m2.s)，氮含量為2.5mg/L，細胞濃度為16.3X 107cells/mL，胞內(nèi)磷含量為76.6pg/L/cell的金藻經(jīng)過不同濃度H202處理8h后的細胞濃度、中性脂含量和相對產(chǎn)油量變化趨勢圖。
[0016]圖4培養(yǎng)體系光照強度為180ymOl/(m2.s)，氮含量為2.5mg/L，細胞濃度為16.3X107cells/mL，胞內(nèi)磷含量為76.6pg/L/cell的金藻經(jīng)過12mM H202處理前后的尼羅紅染色顯微圖片(注:圖中白色箭頭指向的白色亮點為儲油細胞器——油體)。
[0017]圖5培養(yǎng)體系光照強度為180 μ mol/(m2.s)，氮含量為24.2mg/L,細胞濃度為8.5X 107cellS/mL，胞內(nèi)磷含量為97.8pg/L/cell的金藻經(jīng)過不同濃度H202處理8h后的細胞濃度、中性脂含量和相對產(chǎn)油量變化趨勢圖。
[0018]圖6培養(yǎng)體系光照強度為180ymOl/(m2.s)，氮含量為24.2mg/L，細胞濃度為8.5X 107cells/mL，胞內(nèi)磷含量為97.8pg/L/cell的金藻經(jīng)過12mM H202處理前后的尼羅紅染色顯微圖片(注:圖中白色箭頭指向的白色亮點為儲油細胞器——油體)。
[0019]圖7細胞濃度為2.9X 107cells/mL的富營養(yǎng)的微擬球藻經(jīng)過0.7mM H202處理8h后的相對產(chǎn)油量變化趨勢圖。
[0020]圖8細胞濃度為2.9X 107cells/mL的富營養(yǎng)的微擬球藻經(jīng)過0.7mM H202處理前后的尼羅紅染色顯微圖片(注:圖中白色箭頭指向的白色亮點為儲油細胞器——油體)。
[0021]圖9細胞濃度為0.lX107cells/mL的富營養(yǎng)的新月菱形藻經(jīng)過0.35mM H202處理8h后的相對產(chǎn)油量變化趨勢圖。
[0022]圖10細胞濃度為0.lX107cellS/mL的富營養(yǎng)的新月菱形藻經(jīng)過0.35mM H202處理前后的尼羅紅染色顯微圖片(注:圖中白色箭頭指向的白色亮點為儲油細胞器——油體)。
[0023]圖11細胞濃度為8.lX106cells/mL的富營養(yǎng)的鹽生杜氏藻經(jīng)過1.5mM H202處理8h后的相對產(chǎn)油量變化趨勢圖。
[0024]圖12細胞濃度為8.1 X 106cells/mL的富營養(yǎng)的鹽生杜氏藻經(jīng)過1.5mM H202處理前后的尼羅紅染色顯微圖片(注:圖中白色箭頭指向的白色亮點為儲油細胞器——油體)。
【具體實施方式】
[0025]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細說明:
[0026]實施例1
[0027]以定鞭藻門的湛江等鞭金藻(1.zhangjiangensis)為供試生物材料，藻種來自FACHB藻種保存中心。用Water-PAM葉綠素熒光儀檢測藻細胞光合活性強弱，以葉綠素熒光參數(shù)FyFm大于0.68的金藻作為藻種，3.0X 106cellS/mL的細胞密度接種至600mL管式鼓泡光生物反應(yīng)器，光暗時間比為14:10，平均光照強度為125 μ mol/(m2.s)的單側(cè)光，C024 % (體積分數(shù))，通氣速率100mL/min，培養(yǎng)體系含500mL經(jīng)0.45 μ m醋酸纖維濾膜過濾，0.4X105Pa滅菌15min的天然海水以及三份f/2培養(yǎng)基(一份f/2培養(yǎng)基配方為75mg/L NaN03，5mg/L NaH2P04.Η20，3.15mg/L FeCl3.6Η20，4.36mg/L Na2_EDTA，0.0098mg/L CuS04.5H20，0.0063mg/L Na2Mo04.2H20，0.022mg/L ZnS04.7H20，0.0lmg/L CoCl2.6H20,0.18mg/L MnCl2.4H20，0.0005mg/L VB12,0.lmg/L