抗α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法，具體地，涉及抗人α-抗胰蛋白酶多克 隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] α-抗胰蛋白酶（a-antitrysin)又稱(chēng)α-1-蛋白酶抑制劑。它是人類(lèi)血衆(zhòng)中最 重要的蛋白酶抑制劑，占血漿總蛋白酶抑制能力的90%以上。它能抑制多種絲氨酸內(nèi)切肽 酶（serineendopeptidase)，如中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（ΝΕ)、胰蛋白酶、血衆(zhòng)素、凝血酶等， 其主要作用是保護(hù)機(jī)體正常細(xì)胞和器官不受蛋白酶的損傷，抑制感染和炎癥，維持機(jī)體內(nèi) 環(huán)境的平衡。血漿中的抗胰蛋白酶主要由肝臟產(chǎn)生，其它如腸、腎、脾等也能產(chǎn)生少量，這些 肝外合成的抗胰蛋白酶在局部組織損傷的調(diào)節(jié)中起重要作用。α-抗胰蛋白酶是人體內(nèi)血 清蛋白溶解酶（如胰蛋白酶）的主要抑制物。
[0003] 蛋白酶-抗蛋白酶系統(tǒng)失衡在肺氣腫、肺囊性纖維化（CF)、急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS)和急慢性支氣管炎等一些炎癥性肺疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用?？功?抗胰蛋白 酶是下呼吸道中最主要的蛋白酶抑制劑，為了恢復(fù)蛋白酶-抗蛋白酶平衡，抗α-抗胰蛋白 酶替代或補(bǔ)充治療不僅成為先天性抗α-抗胰蛋白酶缺乏癥的主要治療方法，而且也為其 它炎癥性肺疾病的治療開(kāi)辟了新的途徑。
[0004] 抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體除用于基礎(chǔ)研究外，還可用于制備高純品抗人 抗胰蛋白酶及制備抗人α_抗胰蛋白酶檢測(cè)試劑?？谷甩羅抗胰蛋白酶凝固活性和抗 原含量檢測(cè)都可以利用抗人α-抗胰蛋白酶抗體。國(guó)內(nèi)目前尚未見(jiàn)研制人血漿抗α-抗胰 蛋白酶多克隆抗體的報(bào)道，也無(wú)高純度抗人α-抗胰蛋白酶產(chǎn)品，而要通過(guò)制備高純品抗 人α-抗胰蛋白酶和抗人α-抗胰蛋白酶檢測(cè)試劑必須先制備出抗人α-抗胰蛋白酶多隆 抗體。
[0005] 因而，本領(lǐng)域中存在著對(duì)抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞株及其制備方法。
[0007] 在第一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種制備分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜 交瘤細(xì)胞株的方法（在本文中有時(shí)也簡(jiǎn)稱(chēng)為"本發(fā)明的方法"），所述方法包括以下步驟：
[0008] 1)制備免疫抗原：通過(guò)同型雙功能蛋白交聯(lián)劑將人α-抗胰蛋白酶與牛血清白蛋 白偶聯(lián)，得到人α-抗胰蛋白酶-牛血清白蛋白偶聯(lián)物；
[0009] 2)免疫小鼠：采用小劑量多次免疫方案，利用步驟1)中得到的人α-抗胰蛋白 酶-牛血清白蛋白偶聯(lián)物作用免疫抗原，對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫；
[0010] 3)細(xì)胞融合：將SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞與步驟2)獲得的免疫Balb/c小鼠的脾臟 細(xì)胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；
[0011] 4)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)：在步驟3)中融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中選擇性 培養(yǎng)后，選擇小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠雜交瘤細(xì)胞SP2/0的融合細(xì)胞；以及
[0012] 5)鑒定：檢測(cè)步驟4)中獲得的融合的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，鑒定分泌抗人 α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0013] 在第二個(gè)方面，本發(fā)明提供了分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞 株（下文中有時(shí)稱(chēng)為"本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株"），所述雜交瘤細(xì)胞株是通過(guò)本發(fā)明的方法 制備的。
[0014] 在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)本發(fā)明的方法制備的一株雜交瘤細(xì)胞株于2015 年11月6日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)武漢大學(xué)保藏 中心，保藏編號(hào)為CCTCCC2015194,培養(yǎng)物名稱(chēng)為：雜交瘤細(xì)胞株α-antitrypsin-P-Ol。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 定義：
[0016] "蛋白交聯(lián)劑"是一類(lèi)小分子化合物，其分子兩端各有一個(gè)或者更多個(gè)針對(duì)特殊基 團(tuán)（-nh2、-cooh、-hs等）的反應(yīng)性末端，可以和生物分子上的活性基團(tuán)分別偶聯(lián)，從而使這 些分子結(jié)合在一起。蛋白交聯(lián)劑可分為同型雙功能交聯(lián)劑（也稱(chēng)為"同源交聯(lián)劑")、異型雙 功能交聯(lián)劑（也稱(chēng)為"異源交聯(lián)劑"）和光活化交聯(lián)劑（也稱(chēng)為"光反應(yīng)性交聯(lián)劑"）三類(lèi)。
[0017] 同型雙功能蛋白交聯(lián)劑的分子兩端具有相同的反應(yīng)性末端或活化反應(yīng)基團(tuán)。常用 的同型雙功能交聯(lián)劑在本領(lǐng)域中是公知的，其非限制實(shí)例包括但不限于，NHS酯類(lèi)交聯(lián)劑諸 如N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)、二硫代雙（琥珀酰亞胺基丙酸酯）（DSP)和3, 3' -二硫代雙 (磺酸琥珀酰亞氨基丙酸酯）（DTSSP)、琥珀酸辛二酸二亞胺（DSS)和丁二烯-苯乙烯共聚 物（BS)、酒石酸二琥珀酰亞胺酯（DST)和Sulfo-DST、雙（2-[琥珀酰亞胺氧羰基氧）乙基） 砜（BS0C0ES)和sulfo-BSOCOES、乙二醇雙[琥珀酰亞胺基丁二酸](EGS)和sulfo-EGS、琥 珀酸辛二酸戊二酸鹽（DSG)、Ν，Ν'-二琥珀酰亞胺基碳酸酯（DSC);碳二亞胺類(lèi)諸如1-乙 基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC);亞氨酯類(lèi)交聯(lián)劑諸如二甲基二亞胺酯 (DMA)、二甲基亞胺酯（DMP)、二甲基苯二酸亞胺酯（DMS)、二叔丁基過(guò)氧化物（DTBP);巰基 反應(yīng)類(lèi)交聯(lián)劑諸如1，4_二（3'-[2'_二硫基吡啶]丙酸酰氨基）丁烷（DTOPB);二氟苯衍 生物的1，5-二氟-2, 4-二硝基苯（DFDNB)、雙（4-氟-3-硝基苯基）亞砜（DFDNPS)等；光 反應(yīng)性交聯(lián)劑類(lèi)交聯(lián)劑諸如雙-[β-(疊氮基水楊?；被┮一鵠二硫化物（BASED)等； 醛類(lèi)交聯(lián)劑諸如甲醛、戊二醛等；雙環(huán)氧化物類(lèi)的1，4-丁二醇縮水甘油醛等；酰肼類(lèi)交聯(lián) 劑諸如己二酸二酰肼、碳酰肼等；雙重衍生物類(lèi)交聯(lián)劑諸如被重氮的〇-聯(lián)甲苯胺、雙重氮 聯(lián)苯胺等；以及雙烷基鹵化物等。
[0018] 光反應(yīng)性交聯(lián)劑是具有光反應(yīng)性基團(tuán)的交聯(lián)劑。同型雙功能交聯(lián)劑的活化反應(yīng)基 團(tuán)也可以是光反應(yīng)性基團(tuán)。
[0019] 表1中列出了部分同型雙功能蛋白交聯(lián)劑的類(lèi)型、反應(yīng)基團(tuán)、蛋白結(jié)合基團(tuán)、光活 化性等性質(zhì)。
[0020] 表 1
[0021]
[0023] "抗體"(antibody)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增 殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。
[0024] 本發(fā)明提供了一種分泌抗人α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其制 備方法。
[0025] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法包括以下步驟：
[0026] 1)制備免疫抗原：通過(guò)同型雙功能蛋白交聯(lián)劑將人α-抗胰蛋白酶與牛血清白蛋 白偶聯(lián)，得到人α-抗胰蛋白酶-牛血清白蛋白偶聯(lián)物；
[0027] 2)免疫小鼠：采用小劑量多次免疫方案，利用步驟1)中得到的人α-抗胰蛋白 酶-牛血清白蛋白偶聯(lián)物作用免疫抗原，對(duì)Balb/c小鼠進(jìn)行免疫；
[0028] 3)細(xì)胞融合：將SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞與步驟2)獲得的免疫Balb/c小鼠的脾臟 細(xì)胞融合，在含有HAT的RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇性培養(yǎng)；
[0029] 4)雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)：在步驟3)中融合后的細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基中選擇性 培養(yǎng)后，選擇小鼠脾臟細(xì)胞與小鼠雜交瘤細(xì)胞SP2/0的融合細(xì)胞；以及
[0030] 5)鑒定：檢測(cè)步驟4)中獲得的融合的雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清，鑒定分泌抗人 α-抗胰蛋白酶多克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0031] 在本發(fā)明的方法中，可以采用本領(lǐng)域中公知的任意同型雙功能蛋白交聯(lián)劑，優(yōu)選 碳二亞胺類(lèi)蛋白交聯(lián)劑，更優(yōu)選roc。
[0032] 在本發(fā)明中，動(dòng)物免疫采用小劑量多次免疫方案，以小鼠為例，常規(guī)以100~ 200μg/只的劑量免疫，免疫3~4次。一個(gè)具體的免疫方案實(shí)例是：使用免疫抗原對(duì)7周 齡的雌性Balb/c小鼠進(jìn)行免疫，按100yg/只的免疫劑量，與弗氏完全佐劑按體積比1:1 混合，乳化達(dá)到油包水狀，將乳化的完全抗原，頸背部多點(diǎn)皮下注射免疫小鼠，2周后，以相 同抗原和等體積的弗氏不完全佐