一種提高劍麻斑馬紋病抗性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提高劍麻斑馬紋病抗性的方法，具體涉及一種從牽牛花中克隆橡 膠素類多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2及其在提高劍麻抗性中的應(yīng)用，尤其適用于在劍麻抗 斑馬紋病中的應(yīng)用，屬于轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 劍麻是主要的熱帶纖維作物，是當(dāng)今世界用量最大、范圍最廣的一種硬質(zhì)纖維，其 纖維質(zhì)地堅韌，具有拉力強、抗撕裂、耐磨、耐腐蝕、耐鹽堿等特性，廣泛應(yīng)用于國防、航海、 交通運輸、石油、冶金等領(lǐng)域，劍麻莖心是釀造龍舌蘭酒的主要原料，劍麻麻渣含有較高皂 素，可用來制藥，同時劍麻也是一種重要的生物質(zhì)能源，有非常重要的經(jīng)濟價值。
[0003] 劍麻原產(chǎn)于墨西哥等熱帶、亞熱帶地區(qū)，我國保存的種質(zhì)資源有80余份，種質(zhì)資 源嚴(yán)重缺乏。目前的主栽品種H. 11648是1963年從坦桑尼亞引進，其種植面積占劍麻總面 積的98%以上。由于該品種抗真菌能力差，加上單一品種多年種植，品種退化嚴(yán)重，病蟲害 不斷滋生，嚴(yán)重影響了劍麻產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此培育出抗病高產(chǎn)品種或?qū)ΜF(xiàn)有品種遺傳改良 已迫在眉睫。
[0004] 劍麻生命周期長，一生僅開一次花，花期不遇現(xiàn)象普遍存在，加上我國劍麻種質(zhì)資 源嚴(yán)重缺乏，多倍體廣泛存在，要在短期內(nèi)培育出高產(chǎn)抗性強的品種十分困難。因此，尋求 高效快速的方法便成了育種學(xué)家們的首要任務(wù)，同時也是劍麻產(chǎn)業(yè)中的主要問題之一。
[0005] 隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，各種技術(shù)方法日益成熟和完善，利用基因工程技術(shù) 對現(xiàn)有種質(zhì)資源進行遺傳改良已廣泛應(yīng)用于作物育種中，并在擬南芥、番茄、馬鈴薯、水稻 等作物中已有許多成功的報道，同時也為劍麻生物技術(shù)育種提供了參考。
[0006] 植物多肽抗生素是一類對細(xì)菌、真菌等微生物及某些昆蟲和動植物細(xì)胞具有抑制 或殺滅作用的小分子多肽，其結(jié)構(gòu)和組成復(fù)雜多樣，目前已發(fā)表的植物多肽抗生素主要有 薺菜素、環(huán)肽、脫皮素、硫素、植物防御素、轉(zhuǎn)脂蛋白、橡膠素、打結(jié)素和鳳仙花素，其中橡膠 素為含有29-44aa，可能含有3對、4對或5對二硫鍵的小分子多肽。研究表明橡膠素對 革蘭氏陽性菌和真菌表現(xiàn)出抗性。曾有報道稱，在千穗谷莧菜中克隆了一個橡膠素類多肽 Ah_AMP2基因，該基因在煙草中表達后，可提高煙草對煙草青枯病和黑脛病的抗性。
[0007] 劍麻斑馬紋病主要致病菌為煙草疫霉，田間病株多數(shù)從葉片開始，進而麻莖、葉軸 均會受到侵染，引起葉片壞死、莖腐和軸腐，進而導(dǎo)致整株死亡，此病迅速蔓延，極易造成極 大經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的防治方法還是采用農(nóng)業(yè)措施、化學(xué)藥劑防冶相結(jié)合的綜合防冶措施，從 牽?；ㄖ锌寺∠鹉z素類多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2用于提高劍麻抗性還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高劍麻斑馬紋病抗性的方法， 本方法通過基因工程手段，將外源基因?qū)雱β橹?，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得具有一定抗性的 轉(zhuǎn)基因劍麻植株，本發(fā)明為提高劍麻斑馬紋病的抗性提供了一條新的有效途徑。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本方法采用的技術(shù)方案是： 1.橡膠素類多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2的克隆 以牽?；ǔ墒旆N子為材料，采用改良Trizol法提取總RNA，經(jīng)Ferments公司反轉(zhuǎn)錄試 劑盒合成第一鏈cDNA后，采用RT-PCR的方法克隆AFP1和AFP2基因，AFP1和AFP2基因全 長分別為279bp和276bp，編碼92個氨基酸和91個氨基酸，AFP1和AFP2同源性高達95%以 上，均含有41個氨基酸的小分子信號肽。AFP1和AFP2核酸和氨基酸序列見SEQIDNo. 1、 SEQIDNo.2、SEQIDΝο·3、SEQIDΝο·4。
[0010] 2.植物表達載體構(gòu)建 設(shè)計帶酶切位點的引物，以第一鏈cDNA為模板，通過PCR擴增目的基因AFP1和AFP2， 通過定向酶切和與載體PISV2678連接，并電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105,構(gòu)建含有目的基因AFP1 和AFP2的植物表達載體。表達載體圖譜見附圖1。
[0011] 3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化劍麻 以劍麻H. 11648愈傷組織為受體材料，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法浸染愈傷組織，然后將浸染 后的愈傷組織接種在含有卡那霉素（kan+)和除草劑（Basta)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo) 不定芽，待不定芽長到4-6厘米高時，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上進行生根。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 為：MS基本培養(yǎng)基+0. 1-1.Omg/L萘乙酸NAA+1. 0-3. 5mg/L6-芐氨基腺嘌呤6-BA，不定芽 誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：SH基本培養(yǎng)基+1.0-5. 0mg/L6-芐氨基腺嘌呤6-BA+0-1.5mg/L萘乙酸 NAA+0-1.5mg/L吲噪 3 丁酸IBA+ 200mg/L卡那霉素kan++ 250Kg/L除草劑Basta，生根 培養(yǎng)基為添加200mg/L羧芐霉素的MS基本培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的pH為5. 8-6. 0 ;光照12-14h， 黑暗10-12h，光照強度為2000Lux，溫度28±2°C。待再生植株長出4-5條壯根時，移植到 基質(zhì)為椰糠和河沙(椰糠：河沙=1:1)的塑料遮光大棚中繼續(xù)培育。
[0012] 4.劍麻轉(zhuǎn)化植株的鑒定 取1克轉(zhuǎn)基因植株葉片提取基因組DNA，以DNA為模板，以AFP-F和AFP-R為引物，以非 轉(zhuǎn)基因植株為陰性對照，經(jīng)PCR檢測后發(fā)現(xiàn)基因AFP1和AFP2已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入劍麻。AFP-F: 5' -CACAACAGTGTGGGAGTCAAGCC-3'；AFP-R:5' -CGGTTGATTGGTTTGCAGTGGTAG-3'。PCR檢測 結(jié)果見附圖2d。
[0013] 5.劍麻轉(zhuǎn)化植株抗病性檢測 采用葉面針刺法活體和離體接種煙草疫霉菌，48小時候后觀察病斑擴展情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) 基因植株葉片病斑明顯比非轉(zhuǎn)基因植株小。發(fā)病情況見附圖2f、附圖2g和附圖2h。
[0014] 6.劍麻轉(zhuǎn)基因植株重要防御酶活性測定 采用葉面針刺法活體接種煙草疫霉菌，在接種0小時、24小時、48小時和72小時分別 測定轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植株超氧化物歧化酶（S0D)、過氧化物酶（P0D)、過氧化氫酶（CAT) 和多酚氧化酶（ΡΡ0)的活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株參與活性氧清除的過氧化物酶POD和過氧化 氫酶CAT的活性，參與酚類化合物和木質(zhì)素合成的多酚氧化酶ΡΡ0的活性明顯比非轉(zhuǎn)基因 植株高。具體酶活見附圖3。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：本研究利用分子生物學(xué)的方法，從牽?；ㄖ蟹蛛x橡膠素類 多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2并轉(zhuǎn)入劍麻，提高劍麻抵抗斑馬紋病的能力，與非轉(zhuǎn)基因劍麻 相比，本發(fā)明轉(zhuǎn)AFP1和AFP2基因劍麻在接種煙草疫霉菌后病斑明顯變小，抗性明顯增強； 參與活性氧清除的過氧化物酶P0D和過氧化氫酶CAT的活性，參與酚類化合物和木質(zhì)素合 成的多酚氧化酶PPO的活性明顯比非轉(zhuǎn)基因植株高，為解決劍麻產(chǎn)業(yè)中斑馬紋病的發(fā)生問 題具有重要的理論和現(xiàn)實意義。
【附圖說明】
[0016] 圖1表達載體構(gòu)建路線圖； 圖2轉(zhuǎn)基因劍麻的篩選，PCR檢測和病原菌接種； 其中a為轉(zhuǎn)基因抗性愈傷組織的篩選；b為轉(zhuǎn)基因抗性植株的篩選；c為轉(zhuǎn)基因植株的 移栽；d為轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測；e為轉(zhuǎn)基因植株活體接種煙草疫霉菌；f為轉(zhuǎn)基因植株葉 片接種煙草疫霉菌；g為非轉(zhuǎn)基因植株接種煙草疫霉菌48小時后的發(fā)病情況；h為轉(zhuǎn)基因 植株接種煙草疫霉菌48小時后的發(fā)病情況； 圖3病原侵染過程中重要防御酶CAT、POD、S0D、ΡΡ0活性變化情況； 其中a為過氧化氫CAT酶活、b為過氧化物P0D酶活、c為超氧化物歧化酶S0D酶活、d為多酸氧化酶ΡΡ0酶活。
【具體實施方式】
[0017] 下面通過實例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明，這些實例僅用來說明本發(fā)明，并不限 制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實施例1 本發(fā)明所提供的2個橡膠素類多肽蛋白酶基因AFP1和AFP2,均從牽?；ㄖ锌寺〉玫?， 其核酸序列分別為SEQIDNo.1和SEQIDNo.2 (序列1和序列2)。
[0019] AFP 1和AFP2基因編碼的蛋白質(zhì)，命名為AFP 1和AFP2蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ IDNo.3和SEQ IDNo.4(序列3和序列4)。
[0020] 一.橡膠素類多肽蛋白酶基因（AFP1和AFP2)的克隆 上述AFP1和AFP2基因的克隆包括如下步驟： 1.RNA提取 取1克牽?；ǔ墒旆N子加入0. 1克PVP40,迅速用液氮研磨成粉末， 加入4mL70%丙酮（2%β-疏基乙醇)，充分混勾，8000rpm，10 °C離心3min，重復(fù)1-2次。 然后加入4 1^1^加1裂解液，室溫放置51^11，加入800卜1^酚：氯仿：異戊醇（25:24 :1)， 混勾后12,000rpm離心10min，取上清，加入800PL氯仿：異戊醇（24:1)抽提，最后加入2 mL異丙醇室溫靜置30min以沉淀核酸，沉淀經(jīng)70%乙醇和無水乙醇各洗滌1次后用ddH20 溶解，取2μL總RNA在含有Goldenview的1. 5 %瓊脂糖凝膠中電泳10分鐘，并拍照保 存。其余的RNA-80°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021] 2. RT-PCR克隆AFP1和AFP2基因 具體步驟如下： 取1克總RNA，采用Ferments公司的反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA，具體 操作按照說明書進行。然后以cDNA為模板，根據(jù)已報道的基因序列設(shè)計特異性引物，用 Transgene公司的pfu高保真酶進行特異PCR擴增，50yL反應(yīng)體系：10yL5Xbuffer， 5yLdNTP(10mmol/L)，上下游引物（10μ mol/L)各 1yL，酶（5U/L) 1yL，cDNA2 yL，水 29yL。反應(yīng)程序為 95°C5min，[95°C30s，52°C30s，72°C40s] 30 個 循環(huán)，72°C10min。所用AFP1 正向引物：5'-ATGAAATACTGTACTATGTT-3'，AFPl反向引物 5'-TCAGTTGGCACCGCCGGCGG-3'。AFP2正向引物和反向引物分別與AFP1正向引物和反向 引物序列相同。
[0022] 取10yLPCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增片段大小