一種適于茄果類主要蔬菜的高效、快速dna提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種改良DNA提取緩沖液及其制備與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA是儲(chǔ)存遺傳信息的載體。在生物學(xué)的研究中，獲得高質(zhì)量的DNA尤為重要?，F(xiàn) 在已經(jīng)發(fā)表的植物基因組DNA提取方法已有多種。目前，研究者最常用的方法為CTAB法、 試劑盒法和SDS法。但CTAB法、試劑盒法和SDS法在進(jìn)行植物基因組DNA提取的過程中有 步驟多、操作繁瑣、耗時(shí)、使用高毒試劑等缺點(diǎn)。在需要獲得大量DNA樣品的實(shí)驗(yàn)中，DNA的 提取就成了難題。
[000引因此，一種高效、快捷、低成本、較無害的DNA提取方法對(duì)于需要大量提取植物DNA進(jìn)行研究的研究者來說，就顯得尤為重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種改良DNA提取緩 沖液及其制備與應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的化及其他相關(guān)目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種改良DNA提取緩沖液，每1000ml所述DNA提取緩 沖液中，含有焦亞硫酸鋼10~30邑。
[0007] 優(yōu)選地，每1000ml所述DNA提取緩沖液中，含有焦亞硫酸鋼10~20g。更優(yōu)選， 20邑。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選地，每1000ml所述DNA提取緩沖液中還含有Tris-肥1 200mmol、 化C1250mmol、邸ΤΑ25mmol、SDS5g。
[0009] 優(yōu)選地，所述DNA提取緩沖液的溶劑為水。所述化is-肥1的抑為7. 5。
[0010] 本發(fā)明的第二方面，提供了前述改良DNA提取緩沖液的制備方法，亦即將各組分 按配比混合即可。 W11] 本發(fā)明的第Ξ方面，提供了前述改良DNA提取緩沖液在植物DNA提取中的用途。
[0012] 本發(fā)明的第四方面，提供一種植物DNA提取方法，所述方法采用前述改良DNA提取 緩沖液來提取植物DNA。
[0013] 優(yōu)選地，所述方法，包括如下步驟：
[0014] 妨將新鮮的植物組織洗凈、吸干，加入改良DNA提取緩沖液，研磨；
[0015] (6)將步驟（1)中研磨獲得的樣品水浴，加冰醋酸鐘，震蕩搖勻，離屯、，保留上清 液；
[0016] (7)在步驟（2)獲得的上清液中加入異丙醇，離屯、，取沉淀；
[0017] (8)在步驟（3)獲得的沉淀中加入乙醇，放置足夠時(shí)間，將乙醇倒出，加入適量TE 或(1地2〇溶解，保存即可。
[0018] 優(yōu)選地，步驟（1)中，所述植物組織為植物的葉子。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（1)中，所述植物選自茄果類。更優(yōu)選地，所述植物選自番茄、黃瓜、 茄子之任一。
[0020] 優(yōu)選地，步驟（1)中，每0. 07-0.Ig植物組織添加1ml的改良DNA提取緩沖液。
[0021] 優(yōu)選地，步驟（1)中，每1000ml所述改良DNA提取緩沖液中含有焦亞硫酸鋼10~ 30邑。
[0022] 更優(yōu)選地，每1000ml所述DNA提取緩沖液中，含有焦亞硫酸鋼20邑。
[0023] 進(jìn)一步優(yōu)選地，每1000ml所述DNA提取緩沖液中還含有Tris-肥1 200mmol、 化C1250mmol、邸ΤΑ25mmol、SDS5g。
[0024] 優(yōu)選地，所述Tris-肥1的抑為7. 5。
[0025] 優(yōu)選地，步驟（4)中，采用70 %乙醇。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0027] 茄果類植物DNA提取中由于褐色多酪類化合物的存在易出現(xiàn)變色現(xiàn)象，為避免運(yùn) 種褐化影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明所采用的改良后的SDS法在提取緩沖液中加入1-3% (W/V)的焦亞硫酸鋼，W助于除去多酪類雜質(zhì)。同時(shí)，在提取DNA的過程中，本發(fā)明的改良 法較傳統(tǒng)SDS法省去了加入等體積氯仿：異戊醇（24 :1)運(yùn)一步驟，僅留下加入等體積異丙 醇運(yùn)一步驟，W保證DNA析出。傳統(tǒng)SDS法中加氯仿：異戊醇（24:1)，主要目的是提苯酪、 快速分層、去氣泡，但改良法在提取液內(nèi)加入1-3% (W/V)的焦亞硫酸鋼時(shí)就已經(jīng)起到了去 多酪雜質(zhì)的作用。同時(shí)，改良法省去加入等體積氯仿：異戊醇（24:1)運(yùn)一步驟，不但避免 了人體接觸氯仿和異戊醇運(yùn)種劇毒試劑，也節(jié)約了時(shí)間和耗材。經(jīng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)證明此改良法 的DNA提取獲得率是其他傳統(tǒng)方法的二到Ξ倍，并且僅需其他傳統(tǒng)方法的Ξ分之一到Ξ分 之二時(shí)長即可，獲得的DNA質(zhì)量完全能滿足PCR的需求。
【附圖說明】 陽02引 圖1 種方法提取DNA所用時(shí)間比較（min)。
[0029] 圖2 :不同提取方法獲得的DNA在瓊脂糖上的檢測結(jié)果，其中，Μ:化2000marker; 1-5:CTAB法提取的DM;6-10 :試劑盒法提取的DM; 11-15 :本發(fā)明改良SDS法提取的DM。
[0030] 圖3 :利用SSR標(biāo)記進(jìn)行番茄雜交種純度檢測的結(jié)果圖。
[00川圖4:利用SSR標(biāo)記進(jìn)行茄子雜交種純度檢測的結(jié)果圖。 陽0巧圖5:利用SSR標(biāo)記進(jìn)行黃瓜雜交種純度檢測的結(jié)果圖。 陽03引圖6 :W番茄為模板，采用本發(fā)明改良SDS法，W1% (W/V)焦亞硫酸鋼的SDS提取 緩沖液W及3 % (W/V)焦亞硫酸鋼的SDS提取緩沖液提取DNA，每個(gè)方法有5組平行樣品， 得到的DNA溶液在1. 2 %的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳所得結(jié)果分別如左列1-5和右列6-10兩 組所示，DNA條帶清晰，DNA質(zhì)量符合要求，Μ:DL2000marker。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 在進(jìn)一步描述本發(fā)明【具體實(shí)施方式】之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護(hù)范圍不局限于下 述特定的具體實(shí)施方案；還應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明實(shí)施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體 實(shí)施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的試驗(yàn)方法， 通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。
[0035]當(dāng)實(shí)施例給出數(shù)值范圍時(shí)，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個(gè)數(shù)值范圍的兩個(gè)端 點(diǎn)W及兩個(gè)端點(diǎn)之間任何一個(gè)數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和 科學(xué)術(shù)語與本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實(shí)施例中使用的具體方法、設(shè)備、 材料外，根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可W使用與本 發(fā)明實(shí)施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實(shí) 現(xiàn)本發(fā)明。
[0036]除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法、制備方法均采用本技術(shù) 領(lǐng)域常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、重組DNA技 術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。運(yùn)些技術(shù)在現(xiàn)有文獻(xiàn)中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor L油oratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons，化w York,1987and periodic updates ;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998 ;METH0DS IN ENZYMOLOGY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. Wolffe，eds. )，Academic Press，San Diego， 1999;和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, C虹omatin Protocols (P.B. Becker, ed. )Humana Press, Totowa，1999等。
[0037]下例實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如樣品水浴、 DNA用70%的乙醇洗涂、DNA用TE溶解并保存、瓊脂糖電泳等過程。 陽0測實(shí)施例1
[0039] W番茄為模板，用CTAB法（方法一）、試劑盒法（方法二）和本發(fā)明改良SDS法 (方法Ξ )分別提取5份樣本的DNA。 W40]其中，CTAB提取方法（方法一）所用到的化學(xué)試劑包括：
[0041] 氯仿：異戊醇（24:1);異丙醇；75%乙醇；口'48;化(：1;邸了4-胞2.2&0;化13;冰 乙酸；棚酸；0 -琉基乙醇；NaAc;氯仿（立氯甲燒）；異戊醇；無水乙醇；漠酪藍(lán)鴻脂糖； 薦糖；漠化乙錠巧B) ;RNase、化0H;肥1 (濃）；d地2〇 ;提取緩沖液0). 35MGlucose、Tris. 肥1、Na.邸TA、2%PVP、1 % (V/V)β-Me、d地20)(冰?。居们凹应?琉基乙醇】、裂解緩沖 液65。(：（水?。?.41胞(：1、0.11化13.肥1、2〇1111胞.邸了八、2%押八8、2%?￥口、1%(￥/￥) β-Me、d地20)。
[0042]具體實(shí)驗(yàn)方法包括如下步驟：
[0043] (1)取lOOmg鮮嫩的葉子，放入研鉢中加入液氮進(jìn)行研磨，直至粉碎；轉(zhuǎn)移到2血 的離屯、管中； W44] 0)向陽管中加入800μL的提取緩沖液（使用前先冰浴lOmin并用震蕩機(jī)混 勻）；離屯、4°C，10000r，15min;
[0045] (3)棄上清液，加入800μL裂解緩沖液；牙簽攬拌混勻；65°C水浴30-40min，同時(shí) 每lOmin充分搖勻一次；
[0046] (4)加入等體積氯仿異戊醇（24 :l)800uL;顛倒搖勻50次；離屯、4°C，lOOOOr， 15min;吸上清液轉(zhuǎn)移至1. 5血的離屯、管中；加入異丙醇化00yL，至少30min);沉淀析出， 靜置；離屯、4°C，lOOOOr，lOmin;倒掉離屯、管中的溶液；
[0047]妨加75%乙醇，洗涂3min;倒出乙醇；通風(fēng)楓中風(fēng)干； W4引 （6)加入100μLTE溶解稀釋。4°C保存。 W例其中，試劑盒提取方法（方法二）所用到的試劑包括：
[0050]Ezup柱式植物基因組DNA試劑盒（上海生物工程有限公司）：純化套件（吸附柱+ 收集管），BufferPC