表達(dá)乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因雞及其實(shí)現(xiàn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因雞，特別是涉及一種表達(dá)乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因雞及其實(shí)現(xiàn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳鐵蛋白最初由Sorensen等于1939年在動(dòng)物乳中發(fā)現(xiàn)，并由Groves首先從牛乳中分離獲得，因與鐵結(jié)合形成的復(fù)合物呈紅色，故稱之為“紅蛋白”。
[0003]1961年，Blanc和Isliker將從人乳中分離獲得的此種蛋白正式命名為乳鐵蛋白。乳鐵蛋白是一種相對分子質(zhì)量約為SOOOODa的鐵結(jié)合性糖蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物乳汁，特別是初乳中和其他多種組織及其分泌液中，包括淚液、精液、膽汁、滑膜液等內(nèi)、夕卜分泌液和嗜中性粒細(xì)胞，為每天大量病源微生物入侵的黏膜系統(tǒng)提供了第一道也是最重要的防線。
[0004]人乳中乳鐵蛋白濃度約為1.0-3.2mg/ml，是牛乳中的10倍(牛乳中含量為0.02-0.35mg/ml)，占普通母乳總蛋白的20%。在泌乳期間，乳鐵蛋白含量隨著泌乳時(shí)間的不同而發(fā)生變化，如人初乳中乳鐵蛋白可達(dá)6-14mg/ml，常乳期降至lmg/ml。而在乳清蛋白產(chǎn)品中，其濃度可高達(dá)30?100mg/ml。乳鐵蛋白之所以被重視乃是因?yàn)樗梢詩Z走細(xì)菌生長所需的鐵質(zhì)而抑制細(xì)菌的生長，或破壞細(xì)菌細(xì)胞膜而具殺死細(xì)菌的效果。且可提升免疫力，抑制病毒所引起的感染，如腸病毒中的輪狀細(xì)菌、腸細(xì)菌71型等等。美國食品藥品管理局早巳允許乳鐵蛋白作為食品添加劑用于運(yùn)動(dòng)、功能性食品。Lactoferrin(乳鐵蛋白)with hypoth1cyanite已經(jīng)被歐洲藥品管理局(EMEA)與美國食品藥品管理局(FDA)評證為孤兒藥品。
[0005]雖然2012年3月30日，我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)——食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將乳鐵蛋白列入GB14880-2012，認(rèn)定為食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑。但是，由于乳鐵蛋白資源稀缺、價(jià)格高昂，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能被普通大眾享用。
[0006]另外，目前養(yǎng)雞都需要注射雞疫苗和使用大量抗菌藥物，不但增加成本、污染環(huán)境，而且還易使病菌變異，造成更大危害。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種能夠?yàn)槠胀ù蟊娞峁┤殍F蛋白源和無需接種疫苗、抗病性強(qiáng)的表達(dá)乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因雞，本發(fā)明目的還在于表達(dá)乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因雞的實(shí)現(xiàn)方法。
[0008]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明表達(dá)乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因雞是通過構(gòu)建表達(dá)乳鐵蛋白的慢病毒載體，再把這種慢病毒載體通過受精種蛋雞胚盤注射后孵化或種公雞睪丸注射后取精子人工受精生出的蛋進(jìn)行孵化，獲得的表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。具有能夠?yàn)槠胀ù蟊娞峁┤殍F蛋白源和無需接種疫苗、抗病性強(qiáng)，顯著降低養(yǎng)殖成本的優(yōu)點(diǎn)。
[0009]作為優(yōu)化，所述構(gòu)建表達(dá)乳鐵蛋白的慢病毒載體為:1)分別調(diào)取P0VApormoter 和 LF 基因；2)將 pOVA pormoter 替換 pLVX-1RES-ZsGreenl 載體上的CMV pormoter,得到 pOVA (pormoter)-MCS-1RES-ZsGreenl 載體；3)將 LF 基因構(gòu)建至pOVA (pormoter)-MCS-1RES-ZsGreenl慢病毒載體上，并使LF基因5’端連接kozak (GCCACC)，使最終骨架結(jié)構(gòu)為 pOVA (pormoter)-kozak-LF-1RES-ZsGreenl ；4)慢病毒載體pOVA (pormoter) -LF和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒pOVA (pormoter) -LF基因的包裝。
[0010]作為優(yōu)化，所述步驟2)與步驟3)之間有測序驗(yàn)證步驟。
[0011]作為優(yōu)化，所述雞胚盤注射獲得表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞步驟為:1)受精種蛋初消毒、大頭朝上放置；2)再消毒后頂端打小孔，剝開雞蛋內(nèi)膜，看見浮在蛋清上面的雞胚；3)用注射器向雞胚注入慢病毒載體；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小雞部分帶有表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。
[0012]作為優(yōu)化，所述受精種蛋初消毒是取受精種蛋用1%新潔而滅消毒；所述大頭朝上放置是大頭朝上放置在蛋托上靜置24小時(shí)；所述再消毒是在大頭上用碘酊消毒，75%的酒精脫碘；所述頂端打的小孔直徑是2至3_ ;向雞胚注入慢病毒載體數(shù)量為10-50微升；所述封口是用石臘封口。
[0013]作為優(yōu)化，所述睪丸注射獲得表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞是臨注射前，將慢病毒濃縮液加入Polybrene至最終濃度3ug/ml混均待用；取4_15周齡公雞進(jìn)行全身麻醉，按體重肌肉注射公雞，麻醉后，右側(cè)肋骨處開切口，暴露兩側(cè)睪丸，分別隨機(jī)點(diǎn)上述混均的注射病毒濃縮液，每側(cè)睪丸注射4-5點(diǎn)，縫合創(chuàng)口，注射破傷風(fēng)一次及青、鏈霉素一周，以防感染；
[0014]公雞飼養(yǎng)一個(gè)月后，取雞精液在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，如果發(fā)現(xiàn)帶有熒光的精子，用這種精子進(jìn)行人工受精，生出的蛋進(jìn)行孵化，孵出的小雞部分帶有表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。
[0015]作為優(yōu)化，所述公雞進(jìn)行全身麻醉是公雞以速眠新II全身麻醉劑，按0.2mL/kg體重肌肉注射公雞；所述右側(cè)肋骨處開切口是右側(cè)肋骨處開2-3cm切口 ；所述每側(cè)睪丸注射4-5點(diǎn)是兩側(cè)共計(jì)注射約0.5mL。
[0016]用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所述表達(dá)乳鐵蛋白轉(zhuǎn)基因雞的方法是構(gòu)建表達(dá)乳鐵蛋白的慢病毒載體，把這種慢病毒載體通過受精種蛋雞胚盤注射后孵化或種公雞睪丸注射后取精子人工受精生出的蛋進(jìn)行孵化，獲得表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。具有易于實(shí)現(xiàn)，可操作性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。
[0017]作為優(yōu)化，所述構(gòu)建表達(dá)乳鐵蛋白的慢病毒載體步驟為:1)分別調(diào)取pOVA pormoter 和 LF 基因；2)將 pOVA pormoter 替換 pLVX-1RES-ZsGreenl 載體上的 CMV pormoter,得到 pOVA(pormoter)-MCS-1RES-ZsGreenl 載體；3)將 LF 基因構(gòu)建至pOVA (pormoter)-MCS-1RES-ZsGreenl慢病毒載體上，并使LF基因5’端連接kozak (GCCACC)，使最終骨架結(jié)構(gòu)為 pOVA (pormoter)-kozak-LF-1RES-ZsGreenl ；4)慢病毒載體pOVA (pormoter) -LF和包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒pOVA (pormoter) -LF基因的包裝。
[0018]作為優(yōu)化，所述步驟2)與步驟3)之間有測序驗(yàn)證步驟。
[0019]作為優(yōu)化，所述雞胚盤注射獲得表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞步驟為:1)受精種蛋初消毒、大頭朝上放置；2)再消毒后頂端打小孔，剝開雞蛋內(nèi)膜，看見浮在蛋清上面的雞胚；3)用注射器向雞胚注入慢病毒載體；4)封口后，放入孵化箱孵化，孵出的小雞部分帶有表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞。
[0020]作為優(yōu)化，所述受精種蛋初消毒是取受精種蛋用1%新潔而滅消毒；所述大頭朝上放置是大頭朝上放置在蛋托上靜置24小時(shí)；所述再消毒是在大頭上用碘酊消毒，75%的酒精脫碘；所述頂端打的小孔直徑是2至3_ ;向雞胚注入慢病毒載體數(shù)量為10-50微升；所述封口是用石臘封口。
[0021]作為優(yōu)化，所述睪丸注射獲得表達(dá)乳鐵蛋白的轉(zhuǎn)基因雞是臨注射前，將慢病毒濃縮液加入Polybrene至最終濃度3ug/ml混均待用；取4_15周齡公雞進(jìn)行全身麻醉，按體重肌肉注射公雞，麻醉后，右側(cè)肋骨處開切口，暴露兩側(cè)睪丸，分別隨機(jī)點(diǎn)上述混均的注射病毒濃縮液，每側(cè)睪丸注射4-5點(diǎn)，縫合創(chuàng)口，注射破傷風(fēng)一次