進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的方法及其相關(guān)應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明通常地涉及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。更具體地，本發(fā)明涉及限制PCR的方法 和進(jìn)行熔解分析，以及其這種方法和分析的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脫氧核糖核酸（DNA)拷貝數(shù)變異（CNV)與某些遺傳性疾病、染色體重排和癌癥相 關(guān)。
[0003] 臨床實(shí)驗(yàn)室通常用于檢測CNV的標(biāo)準(zhǔn)方法是熒光原位雜交（FISH) [13, 14]。FISH 的分辨率是約100千堿基對(duì)（kb)，但是包含較短片段的CNVs很難用這種方法檢測。在人類 基因組序列完成后的近十年中[15]，一些能夠解決更短CNVs的分子檢測技術(shù)已經(jīng)顯示了 存在于正常個(gè)體中的結(jié)構(gòu)變異的顯著水平。
[0004] 在上個(gè)十年中發(fā)展的最流行的技術(shù)有陣列比較基因組雜交（CGH)、陣列單核苷酸 多態(tài)性（SNP)、實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和多重連接探針擴(kuò)增（MLPA)以及大規(guī)模平行測序?；?于陣列的技術(shù)（陣列CGH和陣列SNP)足以用于人類全基因組變異的全球和高分辨率的掃 描[16-19]。靶向于陣列的高密度分辨率已經(jīng)接近了一些堿基對(duì)。在最近幾年中，新一代測 序技術(shù)已經(jīng)用于CNV檢測[20, 21]。上述方法耗時(shí)多并且需要費(fèi)用較高的設(shè)備和試劑。
[0005] 實(shí)時(shí)qPCR可以根據(jù)跨越循環(huán)數(shù)目的閾值變化用于計(jì)算CNVs ( Δ Δ Cq) [22, 23]。這 個(gè)方法迅速且不需要昂貴的設(shè)備。從人類基因組一般觀察到的拷貝數(shù)變異比率可以是10 : 1或者更高，或者小至4 :3。三體綜合征（trisomy)(如：唐氏綜合征）涉及的3 :2的比率 是特別常見的。理論上，qPCR可以用于檢測2 :1的CNV和甚至三體性，但是在實(shí)踐中為了 獲得可信賴的結(jié)果需要極大的關(guān)注，并且通過qPCR識(shí)別較小的比率是非常困難的。qPCR - 般用于基因表達(dá)，然而，對(duì)于拷貝數(shù)的確定，qPCR已經(jīng)在臨床上較少應(yīng)用。
[0006] MLPA被廣泛應(yīng)用于在臨床實(shí)驗(yàn)室中檢測遺傳性疾病相關(guān)CNVs，因?yàn)樗軌驒z 測基因的大量缺失（deletion)和重復(fù)（duplication)(特別是外顯子的缺失和重復(fù)） [24, 25]。然而，MLPA耗時(shí)長并且需要長的定制的寡核苷酸探針。除了實(shí)時(shí)PCR以外，所有 這些方法需要至少一天完成。
[0007] 存在確定CNV和確定基因表達(dá)的可選擇的快速方法的需要。 發(fā)明概述
[0008] 在此公開限制性PCR和進(jìn)行熔解分析的方法。這些方法可以用于各種目的，如確 定遺傳拷貝數(shù)變異（CNVs)和確定基因的相對(duì)表達(dá)水平。
[0009] 例如，在一些【具體實(shí)施方式】中，該方法包括在限制擴(kuò)增中通過聚合酶鏈反應(yīng)對(duì)遺 傳性樣品（genetic sample)的感興趣區(qū)域（或位點(diǎn)（locus))進(jìn)行擴(kuò)增。該方法可以進(jìn)一 步包括確定任何產(chǎn)生的擴(kuò)增子的熔解曲線（melting curve)，然后將熔解曲線與作為參考 的參考曲線進(jìn)行比較，其中兩條曲線之間的不同顯示了遺傳性樣品在感興趣區(qū)域的拷貝數(shù) 變異。
[0010] 在一些【具體實(shí)施方式】中的另外一個(gè)實(shí)施例中，該方法包括在限制擴(kuò)增中擴(kuò)增遺傳 性樣品感興趣區(qū)域并通過聚合酶鏈反應(yīng)也擴(kuò)增參考。該方法可以進(jìn)一步包括確定感興趣區(qū) 域的熔解曲線和參考的參考曲線，然后將感興趣區(qū)域的熔解峰與參考的熔解峰進(jìn)行比較， 其中兩個(gè)峰之間的不同顯示了相對(duì)拷貝數(shù)和表達(dá)水平的不同。
[0011] 還公開了分析PCR熔解溫度數(shù)據(jù)的方法。該方法包括對(duì)遺傳性樣品和參考樣品進(jìn) 行PCR。該方法進(jìn)一步包括獲得未經(jīng)加工的熒光相對(duì)于熔解溫度的數(shù)據(jù)，例如使用光掃描儀 獲得。該方法可包括從未經(jīng)加工的熒光相對(duì)于熔解溫度的數(shù)據(jù)中去除背景噪聲。該方法可 以進(jìn)一步包括標(biāo)準(zhǔn)化所有的熔解溫度數(shù)據(jù)，隨后標(biāo)準(zhǔn)化參考熒光峰高度以顯示遺傳性樣品 峰的不同。
[0012] 還提供進(jìn)行這樣方法的試劑盒。
【附圖說明】
[0013] 圖IA說明用不同濃度的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)的雙倍擴(kuò)增。
[0014] 圖IB說明圖IA表示的雙倍擴(kuò)增的熔解曲線。
[0015] 圖2A說明在第21個(gè)循環(huán)停止的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)擴(kuò)增。
[0016] 圖2B說明在第24個(gè)循環(huán)停止的PCR擴(kuò)增。
[0017] 圖2C說明在第27個(gè)循環(huán)停止的PCR擴(kuò)增。
[0018] 圖2D說明在第30個(gè)循環(huán)停止的PCR擴(kuò)增。
[0019] 圖2E說明在第33個(gè)循環(huán)停止的PCR擴(kuò)增。
[0020] 圖3A說明在標(biāo)準(zhǔn)dNTP濃度下的PCR熔解曲線。
[0021] 圖3B說明在dNTP濃度為100 μ M下的PCR熔解曲線。
[0022] 圖3C說明在dNTP濃度為50 μ M下的PCR熔解曲線。
[0023] 圖3D說明在dNTP濃度為25 μ M下的PCR熔解曲線。
[0024] 圖3Ε說明在dNTP濃度為12. 5 μ M下的PCR熔解曲線。
[0025] 圖3F說明在dNTP濃度為6. 25 μ M下的PCR熔解曲線。
[0026] 圖3G說明在dNTP濃度為3. 125 μ M下的PCR熔解曲線。
[0027] 圖3Η說明在dNTP濃度為1. 56 μ M下的PCR熔解曲線。
[0028] 圖4Α說明在10倍不同濃度的初始樣品的PCR擴(kuò)增。
[0029] 圖4Β說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】的圖IA中擴(kuò)增子的熔解曲線。
[0030] 圖5Α說明在標(biāo)準(zhǔn)聚合酶濃度下的PCR熔解曲線。
[0031] 圖5Β說明在聚合酶濃度為0. 2U/ μ L下的PCR熔解曲線。
[0032] 圖5C說明在聚合酶濃度為0.1 U/ μ L下的PCR熔解曲線。
[0033] 圖說明在聚合酶濃度為0. . 05U/ μ L下的PCR熔解曲線。
[0034] 圖6Α說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】的13-三體綜合征樣品的盲測 概況。
[0035] 圖6Β說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】分析18-三體綜合征樣品的盲 測概況。
[0036] 圖6C說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】分析21-三體綜合征樣品的盲 測概況。
[0037] 圖7說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】分析性染色體的盲測摘概況。
[0038] 圖8說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】分析雜合缺失（heterozygous deletions)〇
[0039] 圖9說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】和不飽和染料分析拷貝數(shù)變異。
[0040] 圖10列出了本文大部分實(shí)施例使用的引物。堿基對(duì)的大小和Tm描述了產(chǎn)生的擴(kuò) 增子。
[0041] 圖11說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】分析癌癥樣品的拷貝數(shù)變異。
[0042] 圖12說明使用本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】的樣品的定量結(jié)果。
[0043] 圖13說明通過在此公開方法和常規(guī)定量PCR兩種【具體實(shí)施方式】確定相對(duì)基因表 達(dá)的相關(guān)性。
[0044] 圖14說明通過本文公開方法的一種【具體實(shí)施方式】分析相對(duì)基因表達(dá)。
[0045] 圖15A說明用IO4拷貝數(shù)擴(kuò)增具有不同濃度的dNTPs人類基因組DNA的稀釋系列 質(zhì)粒 DNA(10nto 101)。
[0046] 圖15B與圖15A類似，除了顯示的是2X稀釋系列（22°to 29)和用214拷貝數(shù)混合 人類基因 DNA。
[0047] 圖16A是相對(duì)峰高度對(duì)拷貝數(shù)比率做圖，其中CXCL9擴(kuò)增子以IO11到10 1拷貝提 供，并且用小鼠 β-肌動(dòng)蛋白cDNA作為參考基因 （reference gene)的IO4拷貝擴(kuò)增。25 μΜ dNTPs用于每一反應(yīng)中。
[0048] 圖16B說明通過qPCR方法和通過相對(duì)峰高度確定的拷貝數(shù)之間的相關(guān)性。在qPCR 方法中，小鼠 cDNA β -肌動(dòng)蛋白參考基因和目標(biāo)基因 CXCL9通過qPCR被分別擴(kuò)增。β -肌 動(dòng)蛋白和CXCL9的Cq被用于計(jì)算CXCL9的拷貝數(shù)。根據(jù)圖16Α的公式來計(jì)算通過熔解峰 確定的CXCL9。
[0049] 圖17Α顯示單個(gè)等位基因擴(kuò)增以確定SMAl基因的拷貝數(shù)。圖17Β與圖17Α相似， 但是表示的是單個(gè)等位基因擴(kuò)增以確定SMA2基因的拷貝數(shù)。 發(fā)明詳述
[0050] 拷貝數(shù)變異（CNV)是常見的遺傳變異類型。人類基因組大約13%的基因在拷貝 數(shù)上具有變異[1]。CNVs與人類疾病和群體多樣性有關(guān)?；蚪M的結(jié)構(gòu)重排，諸如缺失或 重復(fù)，可以引起CNVs。許多遺傳性疾病是由脫氧核糖核酸（DNA)序列的大區(qū)段的遺失或獲 得導(dǎo)致的。例如，1-3%的囊性纖維化病例是由囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CTFR)基因 的大量缺失導(dǎo)致的拷貝數(shù)降低而導(dǎo)致的[2,3]。同樣地，乳腺癌病例的類似部分是由1型 乳腺癌易感基因（BRCAI)和2型乳腺癌易感基因（BRCAII)的大量缺失導(dǎo)致的。在另外的 實(shí)施例中，整個(gè)染色體發(fā)生CNV，諸如在13-三體綜合征，18-三體綜合征和21-三體綜合 征。人類免疫缺陷病毒（HIV)感染的易感性與趨化因子（C-C模體（motif))配體3樣蛋白 1(CCL3L1)基因拷貝數(shù)的增加有關(guān)[7,8]。例如，表皮生長因子受體（EGFR)基因的高拷貝 數(shù)與結(jié)腸癌和非小細(xì)胞肺癌相關(guān)[9-12]。
[0051] 在此公開測定遺傳性CNVs的方法。在一些具體的實(shí)施方式中，該方法包括采用聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)對(duì)遺傳性樣品的感興趣區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)限制感興趣區(qū)域的擴(kuò)增。 該方法進(jìn)一步包括測定任何得到的擴(kuò)增子的熔解曲線，然后將熔解曲線與參考的參考曲線 比較，其中兩曲線之間的不同顯示了拷貝數(shù)變異的存在。
[0052] 在具體的細(xì)胞、組織和/或器官中測定基因的表達(dá)水平由于許多原因是重要的。 在此公開了確定基因的相對(duì)表達(dá)水平的方法。該方法包括采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)擴(kuò)增 遺傳性樣品的感興趣區(qū)域并擴(kuò)增參考樣品，同時(shí)限制擴(kuò)增。該方法進(jìn)一步包括確定感興趣 區(qū)域和參考的熔解曲線，然后將感興趣區(qū)域的熔解峰與參考的熔解峰比較，其中兩峰之間 的不同顯示了相對(duì)表達(dá)水平的不同。
[0053] 感興趣區(qū)域的限制性擴(kuò)增可以包括如下一種或多種：(a)在感興趣區(qū)域擴(kuò)增的平 臺(tái)期之前限制PCR循環(huán)的總數(shù)目；(b)將PCR過程中存在的脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP)的 量限定至足以降低感興趣區(qū)域的擴(kuò)增；或（c)將PCR過程中存在的聚合酶的量限定至足以 降低感興趣區(qū)域的擴(kuò)增。
[0054] 在選項(xiàng)（a)下，PCR循環(huán)可以被限制到大約一個(gè)循環(huán)，在所述一個(gè)循環(huán)中，擴(kuò)增的 感興趣區(qū)域可區(qū)別于也是在擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的背景噪聲，在此所述一個(gè)循環(huán)被稱作"循環(huán) 數(shù)定量（quantification cycle)"或者"Cq"。在一些【具體實(shí)施方式】中，PCR循環(huán)可以被限 定在Cq的正負(fù)3個(gè)循環(huán)內(nèi)。在一些【具體實(shí)施方式】中，PCR循環(huán)可以被限定在Cq的正負(fù)2個(gè) 循環(huán)內(nèi)。在一些【具體實(shí)施方式】中，PCR循環(huán)可以被限定在Cq的正負(fù)1個(gè)循環(huán)內(nèi)。PCR循環(huán) 是Cq的可以取決于最初的模板拷貝數(shù)。在這個(gè)方法中，確定CNV之前先確定樣品的Cq是 必要的。
[0055] 在選項(xiàng)（b)下，開始PCR之前dNTPs的濃度可以被限制到約為標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系 濃度的30 %至約為標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系濃度的1 %，包括約為標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系濃度的25 %， 約12. 5%，約6. 25%，約3. 125%，和約1. 56%。例如，對(duì)于PCR方法一般在開始PCR前可以 使用濃度為200微摩爾（μ M)的dNTPs，這是常用的標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系濃度，然后dNTPs的 濃度可以被限定到約50 μ M至約3. 1 μ M，包括約25 μ M，約12. 5 μ M和約6. 25 μ M。雖然本 文中使用的實(shí)施例對(duì)四種dNTP都進(jìn)行了限定，但是應(yīng)理解的是，一種，兩種或三種dNTPs可 以被如此限定，示例性地取決于GC含量。在選項(xiàng)（c)下，開始PCR前的聚合酶的濃度可以 被限定到約為標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系濃度的50 %至約為標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系濃度的20 %，包括約 為標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系濃度的25%。例如，對(duì)于PCR方法一般使用聚合酶的濃度為約0. 04U/ μ L，然后聚合酶的濃度為約0. 02U/ μ L或約0.0 lU/ μ L。
[0056] 確定遺傳性CNV的方法可以進(jìn)一步包括計(jì)算拷貝數(shù)的百分率差異和/或遺傳性樣 品拷貝數(shù)對(duì)參考的比率。確定基因相對(duì)表達(dá)水平的方法可以進(jìn)一步包括計(jì)算表達(dá)水平的百 分率差異和/或比率。
[0057] 對(duì)于確定遺傳性CNVs的方法，遺傳性樣品可以包括核酸，諸如脫氧核糖核酸 (DNA)或核糖核酸（RNA)。對(duì)于確定基因相對(duì)表達(dá)水平的方法，遺傳性樣品可以包括信使核 糖核酸（m RNA)。當(dāng)樣品包括RNA，諸如mRNA時(shí)，那么該方法可以包括在擴(kuò)增步驟前對(duì)遺傳 性樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
[0058] 在該方法一些【具體實(shí)施方式】中，PCR包括終點(diǎn)PCR。例如，終點(diǎn)PCR可以被用于遺 傳性CNV的相對(duì)或絕對(duì)測定或基因的相對(duì)表達(dá)水平。
[0059] 在該方法一些【具體實(shí)施方式】中，PCR包括實(shí)時(shí)PCR。