三峽庫(kù)區(qū)沿江口岸4種鼠類(lèi)cytB特異序列及分子鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及DNA條形碼領(lǐng)域，具體是三峽庫(kù)區(qū)沿江口岸4種主要鼠類(lèi)cytB特異序 列及分子鑒定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Hebert等在2003年明確提出DNA條形碼的概念，DNA條形碼就是通過(guò)對(duì)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn) 目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行物種鑒定的方法。COI，cytB，16sRNA等基因均可以 被選做條形碼。
[0003] 相較于傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方式，DNA條形碼擁有如下優(yōu)勢(shì)：①分子鑒定技術(shù)可以鑒定鼠 體不完整的標(biāo)本，理論上只需要提取足夠PCR擴(kuò)增反應(yīng)的組織就可以鑒定種群；②技術(shù)簡(jiǎn) 便，簡(jiǎn)捷快速，易于構(gòu)建統(tǒng)一的DNA條形編碼數(shù)據(jù)庫(kù)?？梢詫?shí)現(xiàn)門(mén)、綱、目、科、屬、種、亞種等 不同分類(lèi)水平物種的鑒定，且具有高度的可重復(fù)性；③DNA條形碼技術(shù)不需要像形態(tài)學(xué)鑒 定那樣需要較多經(jīng)驗(yàn)積累。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定依靠外形、頭骨、牙齒等特征，十分依賴(lài)和模 式標(biāo)本的對(duì)比，專(zhuān)業(yè)性強(qiáng)。
[0004] 目前文獻(xiàn)顯示，國(guó)內(nèi)鼠類(lèi)分子鑒定多選用COI基因作為條形碼序列，通過(guò)保守通 用引物從目標(biāo)鼠 DNA擴(kuò)增獲得COI基因，測(cè)序后對(duì)序列進(jìn)行檢索，比對(duì)，能成功地鑒定目標(biāo) 種類(lèi)的種屬情況。但是COI基因相對(duì)較保守，對(duì)于亞種，地理種等鑒定效果不佳，且進(jìn)化速 度較慢，不能對(duì)種內(nèi)不同地理種，不同個(gè)體進(jìn)行區(qū)別。
[0005] 三峽庫(kù)區(qū)是三峽工程建設(shè)后形成的特殊區(qū)域，生態(tài)環(huán)境及鼠類(lèi)種群分布存在其特 殊性。庫(kù)區(qū)口岸主要鼠類(lèi)有黃胸鼠，褐家鼠，小家鼠和黑線(xiàn)姬鼠等。隨著庫(kù)區(qū)口岸開(kāi)放程度， 截獲入境鼠類(lèi)數(shù)量越來(lái)越多。目前，鼠類(lèi)鑒定仍以形態(tài)學(xué)鑒定為主，但不同區(qū)域的同一種鼠 類(lèi)存在遺傳差異，明確其分子鑒定標(biāo)簽基因特征對(duì)鼠類(lèi)快速鑒定十分必要，同時(shí)可彌補(bǔ)傳 統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定的不足。了解本地主要鼠類(lèi)分子鑒定特征十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于以上缺陷，本發(fā)明的第一目的是提供三峽庫(kù)區(qū)沿江口岸4種鼠類(lèi)cytB特異序 列，第二目的是利用上述4種鼠類(lèi)cytB特異序列鑒定黃胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑線(xiàn)姬鼠 的分子鑒定方法。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述第一目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：三峽庫(kù)區(qū)沿江口岸4種鼠類(lèi) cytB特異序列，包括DNA序列為SEQ ID NO. 1的黃胸鼠 cytB基因序列；DNA序列為SEQ ID NO. 2的小豕鼠 cytB基因序列；DNA序列為SEQ ID NO. 3的褐豕鼠 cytB基因序列；DNA序列 為SEQ ID NO. 4的黑線(xiàn)姬鼠 cytB基因序列。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述第二目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：上述4中基因序列在使用分子 鑒定方法鑒定黃胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑線(xiàn)姬鼠中的應(yīng)用，包括以下步驟：
[0009] (I)DNA模板的制備按照DNeasy Blood&Tissue試劑盒使用說(shuō)明書(shū)提取待測(cè)標(biāo)本 的肝臟、肌肉、皮毛或骨骼DNA，獲取模板DNA ;或者采用酚-氯仿抽提法提取待測(cè)標(biāo)本的肝 臟、肌肉、皮毛或骨骼DNA，獲取模板DNA ;
[0010] (2)?0?擴(kuò)增？0?反應(yīng)擴(kuò)增體積為25 4 1^，其中10\緩沖液2.5 4 1^，1〇111111〇1/1(1犯13 2 μ L，25 μ mol/L的DNA序列為SEQ ID NO. 5的正向引物和DNA序列為SEQ ID NO. 6的反向 引物各 1 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0· 2 μ L，模板 DNA 2 μ L，CldH2O 16. 3 μ L ;
[0011] PCR 反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性 5min，94°C變性 30s，55°C退火 60s，72°C延伸 60s，35 個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸IOmin ;
[0012] (3)PCR產(chǎn)物檢測(cè)取5 μ LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖凝膠電泳（120V電壓，電泳 30min)，溴化乙錠或Goldview核酸染料染色，熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)，取電泳效果較好的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物送由生物公司純化后測(cè)序；
[0013] (4)序列分析將步驟⑶測(cè)得的序列與DNA序列為SEQ ID NO. 1的黃胸鼠 cytB基 因序列，DNA序列為SEQ ID NO. 2的小家鼠 cytB基因序列，DNA序列為SEQ ID NO. 3的褐家 鼠 cytB基因序列和DNA序列為SEQ ID NO. 4的黑線(xiàn)姬鼠 cytB基因序列，進(jìn)行對(duì)比分析，判 斷待測(cè)標(biāo)本的種屬情況。
[0014] 本實(shí)發(fā)明具有以下有益技術(shù)效果：本發(fā)明獲得三峽庫(kù)區(qū)主要鼠類(lèi)cytB特征序列， 為入境截獲鼠類(lèi)種群分子鑒定提供了數(shù)據(jù)參考，能快速進(jìn)行遺傳分析以確定截獲鼠類(lèi)是否 為本地鼠類(lèi)。還能對(duì)種內(nèi)不同地理種，不同個(gè)體進(jìn)行區(qū)別。
[0015] 本發(fā)明提高了鼠類(lèi)組織DNA提取的效率。新鮮的鼠類(lèi)肝臟和肌肉組織DNA提取效 率較高，試劑盒法和酚-氯仿抽提法都能獲得質(zhì)量較高的DNA。對(duì)于腐爛標(biāo)本，因雜質(zhì)較多， 試劑盒法提取效果較差，DNA量不能滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)要求，采用酚-氯仿抽提法，可以在較大 量的腐爛標(biāo)本中提取足夠的DNA用于后續(xù)試驗(yàn)，提取成功率大于80%。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為鼠 cytB基因電泳圖；
[0017] 圖中：M :marker DL2000,1-6 :鼠類(lèi) cytB 目標(biāo)條帶。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 1、標(biāo)本采集與保存。采用鼠籠法或鼠夾法采集捕獲鼠類(lèi)標(biāo)本，也可以收集毒餌法 滅鼠后的死鼠，自然死鼠及腐敗變干的死鼠殘?bào)w等。將活鼠用氯仿或乙醚熏死，取約1-2克 肝臟或肌肉組織冷凍保存。如果為已經(jīng)腐敗的死鼠，取相對(duì)完整的皮毛或骨骼冷凍保存，取 樣時(shí)避免污染。同時(shí)保存整體死鼠標(biāo)本以做形態(tài)學(xué)鑒定。
[0019] 2、DNA模板的制備。（1)試劑盒提?。喝〕鍪占母闻K或肌肉標(biāo)本，剪碎置于干 凈的2mL離心管中，皮毛或骨骼標(biāo)本剪碎后加石英砂液氮冷凍研磨后置于干凈的2mL離心 管中，按照DNeasy Blood&Tissue試劑盒（Qiagen)使用說(shuō)明書(shū)提取DNA，獲得DNA模板， 于-20°C保存?zhèn)溆?。?)酚-氯仿抽提法提?。阂旱賰鍪占拇郎y(cè)樣本組織并研磨，轉(zhuǎn)移 至 IOmL 的離心管，加入 DNA 提取液（Tris-HCl 400mM(pH 8.0);NaCl 150mM;EDTA 60mM; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) lOg/L ;提取 DNA 組織與 DNA 提取液比例約 0· lg/2mL)，混 勾，冰上放置；加入等體積的酸：氯仿：異戊醇（25:24:1)，劇烈的禍旋5min ;8000rpm，4°C， 5min離心，取上清液，再加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提；重復(fù)加入等體積的氯仿： 異戊醇（24:1)抽提步驟，取上清液至新離心管中；加入所取上清液2. 5倍體積無(wú)水乙醇，輕 柔混勻，-20°(：沉淀301^11;10000印111，4°(：，離心101^11收集沉淀；75%乙醇漂洗沉淀，空氣干 燥后，用ddH20溶解沉淀，即得模板DNA。
[0020] 3、引物合成，以下為鼠類(lèi)cytB通用引物，由華大生物技術(shù)有限公司合成。
[0021] DNA序列為SEQ ID NO. 5正向引物：
[0022] 5' -ACCAATGACATGAAAAATCATCGTT-3'
[0023] DNA序列為SEQ ID NO. 6反向引物：
[0024] 5' -TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3'。
[0025] 4、PCR 擴(kuò)增
[0026] PCR 反應(yīng)擴(kuò)增體積為 25 μ L，其中 10 X 緩沖液 2. 5 μ L，lOmmol/L dNTP 2 μ L， 25 μ mol/L的DNA序列為SEQ ID NO. 5的正向引物和DNA序列為SEQ ID NO. 6的反向引物 各 1 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0· 2 μ L，模板 DNA 2 μ L，CldH2O 16. 3 μ L ;PCR 反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變 性5min，94°C變性30s，55°C退火60s，72°C延伸60s，35個(gè)循環(huán)，最后再72°C延伸10min。
[0027] 5、PCR產(chǎn)物檢測(cè)
[0028] 取5 μ L PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，用1 %瓊脂糖凝膠電泳（120V電壓，電泳30min)。溴化乙 錠或Goldview核酸染料染色，熒光成像系統(tǒng)檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖1。
[0029] 6、基因序列測(cè)定
[0030] 選取1到2個(gè)效果較好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送由生物公司純化后測(cè)序（測(cè)序所用引物 與PCR所用引物相同），所得基因序列經(jīng)拼接校正后即為目標(biāo)鼠 cytB序列。
[0031] 7、序列分析
[0032] 將目標(biāo)鼠 cytB序列在GenBank中與其他鼠 cytB基因序列進(jìn)行Blast比對(duì)確定目 標(biāo)鼠種屬情況。將同類(lèi)目標(biāo)鼠 cytB序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定三峽庫(kù)區(qū)主要鼠類(lèi)cytB特征 序列。
[0033] 以下是三峽庫(kù)區(qū)4種主要鼠類(lèi)cytB特征序列
[0034] 黃胸鼠 cytB基因序列，SEQ ID NO. 1 :
[0035] ATGACAACATCCGAAAATCTCACCCCCTATTCAAAATCATCAACCACTCCTTTATCGACCTCCCCGCCC CATCTAACATCTCATCATGATGAAACTTCGGTTCTCTACTAGGAGTATGCCTCATAGTACAAATCCTCACAGGCTTA TTCCTAGCAATACACTACACGTCTGATACCATAACAGCATTTTCATCAGTCACCCACATCTGCCGAGACGTAAACTA CGGCTGACTAATCCGATACCTACACGCCAACGGCGCCTCAATATTTTTCATCTGCCTATTCCTCCATGTGGGACGAG GACTATACTATGGATCCTACACTTTCCTAGAAACCTGAAACATTGGGATCATTCTACTATTTGCAGTCATAGCAACT GCATTCATGGGCTATGTACTCCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCTACAGTAATTACAAACCTATTATCAGC TATCCCTTACATTGGAACTACCCTAGTCGAATGAATCTGAGGAGGCTTCTCAGTAGACAAAGCAACCCTAACACGCT TCTTCGCATTCCACTTCATCCTCCCATTCATTATCGCCGCCCTTGCAATTGTACATCTTCTTTTCCTCCACGAAACA GGATCAAATAACCCCACAGGATTAAACTCCGACGCAGACAAAATCCCATTCCATCCATATTATACAATTAAAGACCT CCTAGGTGTATTTATATTACTATTATTCCTAATAACCCTAGTACTATTCTTCCCAGACCTACTAGGAGACCCAGACA ATTATACACCCGCTAACCCCCTCAACACCCCACCCCACATCAAACCAGAATGATATTTTCTCTTTGCCTACGCTATT CTACGCTCCATTCCCAACAAACTAGGAGGAGTCATAGCCCTAATCTTATCAATCCTAATCTTAGCCTTCCTACCATT CCTGCATACTTCAAAACAACGCAGCTTAACATTCCGCCCAATCACCCAAATCCTTTACTGAATCCTAGTAGCCAACC TCCTAGTCTTAACATGAATCGGAGGCCAACCAGTAGAACACCCATTTATCATTATTGGCCAACTAGCCTCCATCAGC TACTTTTCAATTATCCTCATTCTCATACCAATCTCTGGAATTGTTGAAGACAAAATGTTAAAATGAAAT
[0036] 小家鼠 cytB基因序列，SEQ ID NO. 2 :
[0037] GTAGCTACTGACAACATCCGAAAAACTCACCCCCTATTTAAAATCATTAACCACTCTTTCATCGACCTC CCTGCCCCATCTAACATCTCATCCTGATGAAACTTTGGCTCCCTCCTAGGTCTATGCCTCGTAATTCAAATTCTTAC AGGCTTATTCCTAGCCATACACTACACATCAGACACAATAACAGCATTTTCATCAGTTACACACATTTGCCGAGACG TAAACTATGGATGACTAATTCGATATATACACGCT