一種從d-生物素中分離雜質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種雜質(zhì)的分離方法，具體指從d-生物素中分離富集雜質(zhì)，旨在通過設(shè)計合理方案，使生物素中雜質(zhì)進一步增長，再通過制備色譜分離技術(shù)富集和分離雜質(zhì)。
【背景技術(shù)】
[0002]d-生物素又稱維生素H、輔酶R，是水溶性維生素，也屬于維生素B族，B7。它是合成維生素C的必要物質(zhì)，是脂肪和蛋白質(zhì)正常代謝不可或缺的物質(zhì)。是一種維持人體自然生長、發(fā)育和正常人體機能健康必要的營養(yǎng)素。
[0003]根據(jù)歐洲藥典標準，d-生物素中的已知雜質(zhì)共有8個。事實上在生物素粗品中還存在一個明顯的未知雜質(zhì)，按照美國藥典的液相分析方法，這個雜質(zhì)的保留時間為RT =
2.36-2.59min。根據(jù)對生物素粗品以及氧化后分離的雜質(zhì)的質(zhì)譜分析，這個雜質(zhì)的分子量為261，不同于已知8個雜質(zhì)的分子量，因此本發(fā)明把這個雜質(zhì)視為未知雜質(zhì)。對生物素粗品進行精制，發(fā)現(xiàn)無法有效去除這個未知雜質(zhì)。由于生物素粗品中出現(xiàn)未知雜質(zhì)，我們有必要對其進行提純和分離，制備出高純的雜質(zhì)固體。以便于做進一步的雜質(zhì)分子結(jié)構(gòu)分析，并有利于制備工藝的改進優(yōu)化。
[0004]通過文獻調(diào)研，未發(fā)現(xiàn)有d-生物素微量未知雜質(zhì)提純分離的相關(guān)技術(shù)報道，為解決此技術(shù)問題，本發(fā)明設(shè)計了一種從d-生物素中分離提純微量未知雜質(zhì)的技術(shù)方案，分離得到的雜質(zhì)的純度滿足用于分子結(jié)構(gòu)確證使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明旨在從d-生物素中分離存在的微量的未知前述雜質(zhì)，得到高純度的雜質(zhì)晶體，為進一步確認其分子結(jié)構(gòu)，完善d-生物素雜質(zhì)譜奠定基礎(chǔ)，并有利于指導d-生物素制備工藝的優(yōu)化。
[0006]本發(fā)明采以下技術(shù)方案:
[0007]—種從d-生物素中分離雜質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0008]1)將d-生物素用雙氧水氧化破壞；
[0009]2)通過制備色譜儀分離富集；
[0010]3)濃縮、烘干。
[0011]具體地，上述從d-生物素中分離雜質(zhì)的方法，包括以下步驟:
[0012]1)將d-生物素用雙氧水氧化破壞，得氧化后的生物素水溶液；
[0013]2)將步驟1)所得氧化后的生物素水溶液經(jīng)制備色譜儀分離富集得到含此未知雜質(zhì)的收集液；
[0014]3)將步驟2)所得含此未知雜質(zhì)的收集液進行濃縮、烘干，得到雜質(zhì)固體粉末。
[0015]上述從d-生物素中分離雜質(zhì)的方法，其中:
[0016]優(yōu)選地，所述雙氧水質(zhì)量濃度為5% -10% ;
[0017]優(yōu)選地，所述雙氧水氧化反應(yīng)時間為24_36h，雙氧水氧化反應(yīng)溫度20_40°C ；
[0018]優(yōu)選地，所述制備色譜儀型號為CombiFlash Rf+，分離柱型號為C1886g ;
[0019]優(yōu)選地，所述分離條件:流動相為1 %磷酸氫鈉水溶液:乙腈=70:30，流速20ml/min ；
[0020]優(yōu)選地，所述濃縮為真空濃縮；例如用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；
[0021]優(yōu)選地，所述濃縮溫度為60_75°C，真空度< -0.08Mpa ；
[0022]優(yōu)選地，所述烘干溫度50-60°C ;進一步優(yōu)選為鼓風烘干。
[0023]本發(fā)明所述d-生物素是指d-生物素粗品或成品。
[0024]優(yōu)選地，所述d-生物素粗品其主成分含量為96.0 %以上，進一步優(yōu)選98.0% -98.5% ο
[0025]本發(fā)明所述未知雜質(zhì)定義如下:
[0026]按照美國藥典(USP 35-NF 30 Ρ5918-5919)對d_生物素的液相分析方法，保留時間為RT = 2.36-2.59min的雜質(zhì)定義為未知雜質(zhì)，其分子量為261。
[0027]d-生物素在水中、高溫中穩(wěn)定，不易降解。本發(fā)明將d-生物素在雙氧水中氧化后，其降解明顯，而生物素主峰之前的未知雜質(zhì)峰明顯增加，說明d-生物素經(jīng)氧化后此未知雜質(zhì)的含量顯著提升，有利于此未知雜質(zhì)的分離。
[0028]本發(fā)明還包括按上述方法制備得到的未知雜質(zhì)在d-生物素質(zhì)量控制中的應(yīng)用。本發(fā)明所述方法制備得到的所述未知雜質(zhì)純度高，可作為標準品用于d-生物素的純度檢測和質(zhì)量控制。
[0029]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:本發(fā)明以d-生物素為原料，經(jīng)用雙氧水氧化破壞、制備色譜分離富集、濃縮、烘干等步驟制備得到d-生物素未知雜質(zhì)。
[0030]根據(jù)本發(fā)明制備的未知雜質(zhì)可用于d-生物素成品檢測分析中的雜質(zhì)標準品，以達到有效控制成品質(zhì)量；并有利于指導d-生物素制備工藝的優(yōu)化。本發(fā)明原料易得，操作簡單，雜質(zhì)的HPLC純度彡96.5%，產(chǎn)品收率彡88% (以生物素粗品氧化后雜質(zhì)的含量計)。
【附圖說明】
[0031]圖1為實驗例1中d-生物素粗品的HPLC圖。
[0032]圖2為實驗例1中d-生物素氧化后分離純化后的未知雜質(zhì)(即實施例1樣品)的HPLC譜圖。
[0033]圖3為實驗例1中d-生物素粗品的質(zhì)譜圖。
[0034]圖4為實驗例1中d-生物素氧化后分離純化后的未知雜質(zhì)(即實施例1樣品)的質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0035]本
【發(fā)明內(nèi)容】
結(jié)合以下實施例，作進一步說明，但本
【發(fā)明內(nèi)容】
不僅限于實施例中所涉及的內(nèi)容。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0036]實施例1
[0037]取1.0g d-生物素粗品(主成分含量98.5%，RT = 2.36-2.59min未知雜質(zhì)含量為0.68%，見附圖1)加質(zhì)量濃度為10%的雙氧水20ml，40°C溫度下攪拌反應(yīng)24h，得到氧化后的生物素水溶液。
[0038]將該氧化后的生物素水溶液在CombiFlash Rf+制備色譜儀上通過液體進樣方式進樣，通過色譜柱(C18 86g)進行分離和富集。流動相為1%磷酸氫鈉水溶液:乙腈=70:30，流速20ml/min。在試管中收集到含未知雜質(zhì)的收集液30ml。將收集液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮至干，濃縮溫度75°C，真空度彡-0.09Mpa。固體加水洗滌后，過濾，50°C烘干。得到未知雜質(zhì)白色固體粉末0.4g，收率88% (以生物素粗品氧化后未知雜質(zhì)的含量計)，HPLC歸一化純度(按照美國藥典USP 35-NF 30 P5918-5919方法)96.5% (見附圖2)。
[0039]實施例2
[0040]取1.0g d-生物素粗品(主成分含量98.5%，RT = 2.36-2.59min未知雜質(zhì)含量為0.68% )加質(zhì)量濃度5%的雙氧化20ml，20°C溫度下攪拌反應(yīng)36h，得到氧化后的生物素水溶液。
[0041]將該氧化后的生物素水溶液在CombiFlash Rf+制備色譜儀上通過液體進樣方式進樣，通過色譜柱(C18 86g)進行分離和富集。流動相為1%磷酸氫鈉水溶液:乙腈=70:30，流速20ml/min。在試管中收集含未知雜質(zhì)的收集液32ml。將收集液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮至干，濃縮溫度60°C，真空度彡-0.085Mpa。固體加水洗滌后，過濾，50°C烘干。分別得到未知雜質(zhì)的白色固體粉末0.42g，收率92.4% (以生物素粗品氧化后未知雜質(zhì)的含量計)，HPLC歸一化純度(按照美國藥典USP 35-NF 30 P5918-5919方法)97.2%。
[0042]實施例3
[0043]取1.0g d-生物素粗品(主成分含量98.5%，RT = 2.36-2.59min未知雜質(zhì)含量為0.68% )加質(zhì)量濃度5%的雙氧化20ml，30°C溫度下攪拌反應(yīng)36h，得到氧化后的生物素水溶液。
[0044]將該氧化后的生物素水溶液在CombiFlash Rf+制備色譜儀上通過液體進樣方式進樣，通過色譜柱(C18 86g)進行分離和富集。流動相為1%磷酸氫鈉水溶液:乙腈=70:30，流速20ml/min。在試管中收集含未知雜質(zhì)的收集液30ml。將收集液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上真空濃縮至干，濃縮溫度70°C，真空度<-0.085Mpa。固體加水洗滌后，過濾，50°C烘干。得到未知雜質(zhì)的白色固體粉末0.40g，收率88% (以生物素粗品氧化后未知雜質(zhì)的含量計)，HPLC歸一化純度(按照美國藥典USP 35-NF 30 P5918-5919方法)97.5%。
[0045]實驗例1
[0046]取20mg d_生物素粗品(主成分含量98.5%，未知雜質(zhì)含量0.68% %)，按照美國藥典(USP 35-NF 30 P5918-5919)方法進行質(zhì)譜分析，其質(zhì)譜圖見附圖3。其中存在分子量為261的雜質(zhì)峰。
[0047]取實施例1制得的未知雜質(zhì)按照美國藥典(USP 35-NF 30 P5918-5919)方法進行檢測，其HPLC圖譜見附圖2，質(zhì)譜圖見附圖4。
[0048]從圖1和圖2的HPLC色譜圖可以看出，實施例1制得的未知雜質(zhì)與上述d_生物素粗品中雜質(zhì)的液相色譜出峰時間一致，均為RT = 2.36-2.59min。從圖3和圖4質(zhì)譜圖可以看出制備的未知雜質(zhì)的分子量261，d-生物素粗品中也存在分子量為261的雜質(zhì)。以上表征信息證明本實施例1所得未知雜質(zhì)與上述d-生物素粗品中的存在的雜質(zhì)相符。
[0049]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干合成工藝改進和潤飾，如，雙氧水濃度、氧化反應(yīng)溫度和時間、色譜儀及色譜柱型號、流動相的改變以及流速的改變、濃縮溫度和時間以及烘干溫度等，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
[0050]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1.一種從d-生物素中分離雜質(zhì)的方法，包括以下步驟: 1)將d-生物素用雙氧水氧化破壞； 2)通過制備色譜儀分離富集； 3)濃縮、烘干。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)將d-生物素用雙氧水氧化破壞，得氧化后的生物素水溶液； 2)將步驟1)所得氧化后的生物素水溶液經(jīng)制備色譜儀分離富集得到含未知雜質(zhì)的收集液； 3)將步驟2)所得含未知雜質(zhì)的收集液濃縮、烘干，得到未知雜質(zhì)固體粉末。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述雙氧水質(zhì)量濃度為5%-10%。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述雙氧水氧化反應(yīng)時間為24-36h，雙氧水氧化反應(yīng)溫度20-40 °C。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項所述的方法，其特征在于，所述制備色譜儀型號為CombiFlash Rf+，分離柱型號為 C1886g。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述分離條件:流動相為1%磷酸氫鈉水溶液:乙腈=70:30，流速201111/1^11。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述濃縮為真空濃縮；優(yōu)選地，所述濃縮溫度為60-75°C，真空度彡-0.08Mpa。8.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項所述的方法，其特征在于，所述烘干溫度為50-60°C;優(yōu)選為鼓風烘干。9.根據(jù)權(quán)利要求2-8任一項所述的方法，其特征在于，按照美國藥典對d-生物素的液相分析方法，未知雜質(zhì)保留時間為RT = 2.36-2.59min，其分子量為261。10.權(quán)利要求2-9任一項所述方法制備得到的未知雜質(zhì)在d-生物素質(zhì)量控制中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種從d-生物素中分離雜質(zhì)的方法。本發(fā)明以d-生物素為原料，經(jīng)氧化破壞，顯著提升雜質(zhì)的含量，再經(jīng)制備色譜法分離，可得純度大于90％的未知雜質(zhì)(RT＝2.36-2.59min)。有利于進一步研究本雜質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)和生物素的雜質(zhì)譜，有效提高生物素質(zhì)量控制水平。
【IPC分類】C07D495/04
【公開號】CN105418633
【申請?zhí)枴緾N201510898412
【發(fā)明人】韋亞鋒, 李士橋, 鄭愛, 胡媛, 魏珺璇
【申請人】蚌埠豐原醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2015年12月4日