一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]臍帶和胎盤同屬于胚胎周圍組織，臍帶組織是間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stemcellS，MSCS)的來源。胎盤由胎盤羊膜、絨毛膜和基蛻膜組成。胎盤含有大量的多種干細(xì)胞，胎盤羊膜上皮細(xì)胞(amn1tic epithelial cells，AECs)具有多種干細(xì)胞的特性，其中有一些亞全能干細(xì)胞，其特性非常接近胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ESCs)。而胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞則存在于羊膜上皮細(xì)胞層之下。羊膜起源于胚胎的上皮層，其發(fā)生早于內(nèi)、中、夕卜三個胚層，因此，胎盤亞全能細(xì)胞的分化能力強于起源于其他三個胚層的干細(xì)胞。許多實驗證明它們更容易被誘導(dǎo)分化成為機體的各種細(xì)胞，因此用于臨床治療的潛能就更大，也就具有更大的市場。相比于臍帶，從胎盤中獲取干細(xì)胞的工作還開展的比較少，因此這個研發(fā)項目的意義就更為重大。胎盤絨毛膜也含有大量的間充質(zhì)干細(xì)胞和造血干細(xì)胞(Hematopoietic stem cells，HSCs);但是因為它的體積很大，不容易取材，所以是利用胎盤組織的最后選擇。
[0003]人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)和上皮干細(xì)胞(ESC)移植在治療多種疾病包括治療退行性神經(jīng)病變，新生兒腦缺血和成人腦中風(fēng)，以及癌癥治療中有廣泛的研究，并且已經(jīng)在多個領(lǐng)域得到臨床應(yīng)用。
[0004]通過檢索，發(fā)現(xiàn)如下幾篇與本專利申請相關(guān)的專利公開文獻(xiàn):
[0005]1、人胎盤亞全能干細(xì)胞及其干細(xì)胞庫構(gòu)建方法(CN103966159A)，提供了一種人胎盤亞全能干細(xì)胞，其來源于剝離的人類胎盤羊膜，針對羊膜的上皮層和間充質(zhì)層所含有的細(xì)胞特點，采用了逐步分離的方法，最大限度地減少了羊膜間充質(zhì)層細(xì)胞對胎盤亞全能細(xì)胞的污染，有效地提高了人胎盤亞全能細(xì)胞的干性。該發(fā)明還提供了一種從胎盤羊膜制備人胎盤亞全能干細(xì)胞并建立干細(xì)胞庫的方法，該發(fā)明在剝離人類胎盤羊膜并剪成5 X 5cm組織塊之后，對羊膜的上皮層和間充質(zhì)層采用了逐步分離的方法，首先進(jìn)行蛋白酶溶液消化，其所用的蛋白酶溶液含有胰蛋白酶，膠原蛋白酶II，和EDTA。然后進(jìn)一步使用Fico 11淋巴細(xì)胞分離液梯度離心，采集兩層液面間的細(xì)胞以達(dá)到分離培養(yǎng)一種人胎盤亞全能干細(xì)胞的目的。
[0006]上述發(fā)明方法的組織分離的步驟比較多，要使用大量的很多種的試劑包括價格昂貴的膠原酶II。
[0007]2、一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法(CN104450612A)，公開了一種人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與鑒定方法，采用組織塊貼壁法分離出羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞并傳代培養(yǎng)，對P1-P3代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)的觀察，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞膜表面陽性分子和陰性分子并采用六孔板法檢測細(xì)胞增殖情況，該實驗從胎盤羊膜組織中分離出細(xì)胞是hAMSCs，為進(jìn)一步研究hAMSCs的生物學(xué)和免疫學(xué)特性、分化能力、核型穩(wěn)定性，以及將其作為臨床應(yīng)用的種子細(xì)胞等提供了基礎(chǔ)。該發(fā)明在剝離人類胎盤羊膜之后，用眼科剪剪成很細(xì)小的小塊(約l-2cm)，然后夾取并平鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，，使細(xì)胞在培養(yǎng)中從組織塊游移出來以實現(xiàn)貼壁生長和增殖。當(dāng)細(xì)胞生長融合成片時，用無菌磷酸緩沖鹽水(PBS)洗去羊膜組織塊。
[0008]上述方法雖然避免了使用大量的試劑包括價格昂貴的膠原酶，但是種植的組織塊還是比較大，不能讓組織內(nèi)的細(xì)胞最有效的游移出來。而且手工剪切和鋪放也非常的耗時，用在胎盤羊膜的取材時尚可，但是用在臍帶取材就不實際，因為臍帶組織的量要大得多，而且非常堅硬。
[0009]通過技術(shù)對比，本專利申請與上述兩篇專利公開文獻(xiàn)存在較大的不同。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明目的克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種低成本、簡單快速地從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
[0011 ]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
[0012]—種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，步驟如下:
[0013]⑴臍帶和胎盤羊膜取材和接種:
[0014]①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時紫外線消毒超凈工作臺；
[0015]②配制培養(yǎng)基:完全培養(yǎng)基的組成是:DMEM/F12加完全培養(yǎng)基總體積5%的胎牛血清、完全培養(yǎng)基總體積1%的胰島素、鐵傳遞蛋白和砸的混合添加物，完全培養(yǎng)基中終濃度為20毫微克/毫升的表皮生長因子和完全培養(yǎng)基中終濃度為20毫微克/毫升的堿性纖維母細(xì)胞生長因子，無菌過濾，4°C保存；
[0016]所述DMEM/F12中DMEM:F12的體積比為1:1;所述混合添加物及在混合添加物中的終濃度為胰島素5微克/毫升、鐵傳遞蛋白10微克/毫升和亞砸酸鈉5毫微克/毫升；
[0017]③嚴(yán)格篩選供者，血液化驗排除傳染??；
[0018]④低溫冰盒中運送臍帶和胎盤:機械剝離胎盤羊膜之后，將臍帶和胎盤羊膜分別置于大玻璃皿中，以下步驟都在無菌條件下進(jìn)行，將臍帶剪成lcm長的小段，將胎盤羊膜剪成約5X5cm長的方塊，用磷酸緩沖鹽水+總體積1 %的青霉素+總體積1 %的鏈霉素清洗組織兩次，洗干凈臍帶的血液；
[0019]⑤將臍帶和胎盤羊膜組織放在4°C的磷酸緩沖鹽水中，以防止組織在機械剪碎時過熱而影響到細(xì)胞存活，使用組織剪碎機來分別破碎成1 _3mm的碎塊，使用低速破碎組織，同時保持細(xì)胞活性，得到破碎的臍帶和羊膜組織；
[0020]⑥將破碎的臍帶和羊膜組織分別轉(zhuǎn)移到T175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并用組織刮取器將其平鋪于培養(yǎng)瓶底，小心加入少量完全培養(yǎng)基，使培養(yǎng)液既能覆蓋破碎的臍帶和羊膜組織塊，又不至于使其漂浮起來，置于37°C、飽和濕度5 % C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0021 ]⑵間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增和傳代:
[0022]①培養(yǎng)過程中觀察可見細(xì)胞從組織塊逐漸游移出來，并進(jìn)一步實現(xiàn)貼壁生長和增殖，在培養(yǎng)的第3-4天、當(dāng)細(xì)胞生長融合成片時，用無菌磷酸緩沖鹽水洗去殘存的組織，全部換為新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；
[0023]②此后每4天換一次培養(yǎng)液直到細(xì)胞長滿90-100%培養(yǎng)瓶底面積，便進(jìn)行胰酶消化傳代；
[0024]③胰酶消化傳代:倒棄培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞2次，每T175用10毫升質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為
0.25%的胰酶-EDTA在37°C消化10分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反應(yīng)，1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再懸浮于完全培養(yǎng)基中，按1:4細(xì)胞數(shù)比例傳代到新T175培養(yǎng)瓶中；
[0025]⑶間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞的鑒定:
[0026]①胰酶消化傳到第三代時，用流式細(xì)胞儀鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的純度:
[0027]羊膜上皮細(xì)胞的標(biāo)記物包括:角蛋白CK19，CD29，和⑶34;胎盤和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物包括:⑶73，⑶90，和⑶105 ；
[0028]②流式細(xì)胞儀驗證細(xì)胞純度達(dá)到90%以上，化驗排除常見的傳染病，并排除細(xì)菌，支原體污染，即是符合標(biāo)準(zhǔn)，即得上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的混合物。
[0029]而且，所述步驟⑴③傳染病為包括艾滋病，甲，乙，丙型肝炎和梅毒；或者，所述步驟⑶②傳染病為包括艾滋病，甲，乙，丙型肝炎和梅毒。
[0030]而且，所述步驟⑴⑤中低速為400-800轉(zhuǎn)/分鐘。
[0031]而且，所述上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的混合物的冷凍保存和復(fù)蘇方法，步驟如下:
[0032]⑴取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的混合物，用PBS洗兩次以洗掉FBS，0.25%胰酶-EDTA消化，每T175用10毫升，37°C，10分鐘，待細(xì)胞懸浮后每個T175加入1毫升FBS以中和胰酶反應(yīng)。在1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；
[0033]⑵再按細(xì)胞密度(l-3)X107/ml懸浮于細(xì)胞凍存液中，分裝到2ml凍存管中，使用細(xì)胞凍存盒在_80°C冰箱緩慢降溫凍存，一天之后轉(zhuǎn)移到液氮罐中長期保存?zhèn)溆茫?br>[0034]所述細(xì)胞凍存液組成:總質(zhì)量20 %的DMS0，總質(zhì)量20 %的人血清白蛋白，總質(zhì)量的60%M199培養(yǎng)基；
[0035]⑶使用細(xì)胞前，將凍存管中細(xì)胞在37°C水浴中迅速解凍，在1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，再懸浮于PBS中，制備成細(xì)胞密度為lxl08/ml的細(xì)胞懸液以用作包括移植在內(nèi)的實驗和臨床應(yīng)用，使用之前一直保存在4°C。
[0036]本發(fā)明取得的優(yōu)點和積極效果是:
[0037]本方法成本低、簡單快速，使用組織剪碎機來將臍帶和胎盤羊膜剪碎成極小的碎塊(小于2_3mm)，遠(yuǎn)小于目前任何的方法，極為利于直接接種到培養(yǎng)瓶之后細(xì)胞向組織外游移，從而實現(xiàn)帖壁生長;不使用任何蛋白酶試劑，從而大幅度地降低成本，減少制備時間，增加產(chǎn)量，使得大規(guī)模細(xì)胞制備成為現(xiàn)實;該方法使用添加生長因子及其它營養(yǎng)物的完全細(xì)胞培養(yǎng)基，從而降低胎牛血清(FBS)濃度到5%，但是取得與常規(guī)使用10%FBS同級和更佳的培養(yǎng)效果，節(jié)省了血清，但又不像大多數(shù)無血清培養(yǎng)那樣，造成細(xì)胞增殖放緩或提早分化。
【具體實施方式】
[0038]下面通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0039]本發(fā)明中所使用的試劑，如無特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常用試劑;本發(fā)明中所使用的方法，如無特殊規(guī)定，均為本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)方法。
[0040]—種從臍帶和胎盤羊膜組織同時提取上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，步驟如下:
[0041 ]⑴臍帶和胎盤羊膜取材和接種:
[0042]①高溫消毒手術(shù)器械和大玻璃皿，同時紫外線消毒超凈工作臺；