一種快速dna產(chǎn)物凝膠回收方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速DNA產(chǎn)物凝膠回收方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在基因克隆等多種DNA測序?qū)嶒?yàn)中，需要純化回收聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物進(jìn)行測序與分析。常用鑒定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的方法是瓊脂糖凝膠電泳，相應(yīng)地對于凝膠電泳分離的DNA片段進(jìn)行回收也有多種方法，目前最常用的有低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠回收和試劑盒柱回收法。相對于以前傳統(tǒng)的膠純化回收方法來說，此兩種方法的操作相對簡單，但成本相對較高操作也比較繁瑣和復(fù)雜。
[0003]實(shí)驗(yàn)室最為常用的DNA回收方法是試劑盒柱回收法，如Universal DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)法。該試劑盒采用獨(dú)特的緩沖體系和離心吸附柱，既可從TAE或TBE瓊脂糖凝膠中回收DNA片段，又可用于直接純化PCR產(chǎn)物，能夠滿足多種實(shí)驗(yàn)需要。溶膠液PC中含有pH指示劑，可根據(jù)顏色來判斷溶膠狀態(tài)。使用該產(chǎn)品可回收100 bp-8kb大小的DNA片段，回收率可達(dá)80%。雖然該試劑盒操作并不復(fù)雜，回收效率中上，但其回收操作時長在20-30 min，單次回收成本6-8元人民幣。多數(shù)分子實(shí)驗(yàn)室需要進(jìn)行大量的DNA回收實(shí)驗(yàn)，若使用現(xiàn)有的試劑盒法回收，需要耗費(fèi)很高的時間成本和經(jīng)濟(jì)成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種快速DNA產(chǎn)物凝膠回收方法，主要解決了主流DNA回收方法時間長、經(jīng)濟(jì)成本高等問題。將DNA回收實(shí)驗(yàn)的操作時間壓縮至2 min內(nèi)完成，單次回收成本降低到原來的1/10。不僅大大簡化操作流程，而且降低了時間成本和經(jīng)濟(jì)成本。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
采用4層硅膠膜柱過濾回收DNA片段，一步即可完成回收實(shí)驗(yàn)，用時僅需2 min?；厥辗椒ㄈ缦?
切膠:將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡可能切除多余部分)，直接放入4層硅膠膜柱中；
離心回收:在室溫下，13000 rpm離心2 min，收集管中即為DNA溶液。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、本發(fā)明在2min內(nèi)完成DNA片段回收實(shí)驗(yàn)，大大縮減了操作的時間成本；
2、本發(fā)明單次回收經(jīng)濟(jì)成本不到1元人民幣，相對實(shí)驗(yàn)室常用的DNA回收試劑盒來說成本不足其1/10，大大降低了 DNA回收實(shí)驗(yàn)的經(jīng)濟(jì)成本；
3、本發(fā)明操作極其簡單，一步即可完成DNA回收實(shí)驗(yàn)。
【附圖說明】
[0007]圖1 兩種方法回收2K DNA Marker 2000 bp和500 bp片段結(jié)果，M:2K DNA Marker(購自全式金生物技術(shù)有限公司)10 yL ;1-4:使用本發(fā)明方法回收2K DNA Marker (10yL)2000 bp和500 bp片段結(jié)果，重復(fù)2次；5-6:使用Universal DNA純化回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)回收2K DNA Marker (10 yL) 2000 bp和500 bp片段結(jié)果。
[0008]圖2 兩種方法回收 15K DNA Marker 15000 bp、5000 bp 和 lOOObp 片段結(jié)果，Μ:15Κ DNA Marker (購自寶生物工程有限公司)10 μ L ; 1-3:使用本發(fā)明方法回收15K DNAMarker (10 yL) 15000 bp、5000 bp 和 lOOObp 片段結(jié)果；4_6:使用 Universal DNA 純化回收試劑盒(購自天根生化科技有限公司)回收15K DNA Marker (10 yL) 15000 bp,5000bp和lOOObp片段結(jié)果。
[0009]圖3 兩種方法回收 PCR 產(chǎn)物結(jié)果，M:2K DNA Marker，1:PCR 產(chǎn)物 A1 (20 μ L)，2:試劑盒回收PCR產(chǎn)物Al，3:PCR產(chǎn)物A2(20 yL)，4:本發(fā)明方法回收PCR產(chǎn)物A2。
【具體實(shí)施方式】
[0010]實(shí)施例1
本發(fā)明采用4層硅膠膜柱，離心回收DNA片段，一步完成回收。以該發(fā)明的方法與實(shí)驗(yàn)室最常見的Universal DNA純化回收試劑盒(天根生化科技有限公司)方法做對比試驗(yàn)，回收2K DNA Marker (10 yL)2000 bp和500 bp片段。從回收結(jié)果上看，本方法和試劑盒回收后條帶均比原條帶弱，回收效率在60%~80%。與Universal DNA純化回收試劑盒相比，本方法回收效率相對會低一些，但重復(fù)性很好。由于一般測序?qū)嶒?yàn)及DNA片段純化回收的后續(xù)實(shí)驗(yàn)對DNA回收率的要求并不是很高，滿足回收率40%都可達(dá)到后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。而本方法回收率可達(dá)60%~70%，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
[0011]實(shí)施例2
為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法在回收DNA大片段時的效果，使用本方法與Universal DNA純化回收試劑盒對比回收15K DNA Marker中的15K、5K和IK DNA片段。從回收結(jié)果上看，本方法和試劑盒回收后條帶均比原條帶弱，回收效率在60%~80%。與Universal DNA純化回收試劑盒相比，在回收5000 bp和1000 bp DNA片段時，本方法回收效率相對會低一些，但條帶亮度說明回收產(chǎn)物滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而在15000 bp DNA片段的回收上，回收試劑盒回收率明顯降低，亮度稍低于本方法，說明本方法回收DNA大片段的效果好于回收試劑盒。從不同分子量DNA回收結(jié)果對比，本方法對不同分子量DNA片段的回收率相對穩(wěn)定，不會因?yàn)榉肿恿吭龃蠖档突厥章?。從條帶亮度來看，回收產(chǎn)物滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。
[0012]實(shí)施例3
為了驗(yàn)證本方法滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求，我們使用本方法與Universal DNA純化回收試劑盒對比回收某基因3’ RACE的PCR產(chǎn)物，并分別做了連接、轉(zhuǎn)化和克隆測序。使用某基因3’ RACE引物，50 μ L體系擴(kuò)增獲得兩管PCR產(chǎn)物。分別抽取20 μ L產(chǎn)物跑膠(1%瓊脂糖凝膠)，分別采用兩種方法切膠回收。回收后將PCR產(chǎn)物與對應(yīng)的膠回收產(chǎn)物同時上樣跑膠。與Universal DNA純化回收試劑盒相比，兩種方法回收率相差無幾，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將所得DNA溶液與回收試劑盒所得DNA溶液分別進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化(載體為pEASY-T5 Zero，感受態(tài)細(xì)胞使用Transl-Tl，均購自全式金生物技術(shù)有限公司)，并進(jìn)行測序。兩種方法得到的DNA溶液均可進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率一致，單克隆菌落生長狀態(tài)一致。測序結(jié)果顯示，所得基因序列一致，證明兩種方法在克隆測序?qū)嶒?yàn)中效果相同。該方法已在本實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的大量克隆測序及回收實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，滿足實(shí)驗(yàn)要求。
[0013]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速DNA產(chǎn)物凝膠回收方法，其特征在于:所述方法包括如下步驟: (1)切膠:將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，切除多余部分，直接放入4層硅膠膜柱中； (2)離心回收:在室溫下，13000rpm離心2 min，收集管中即為DNA溶液。
【專利摘要】本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種快速DNA產(chǎn)物凝膠回收方法，將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，切除多余部分，直接放入4層硅膠膜柱中；在室溫下，13000rpm離心2min，收集管中即為DNA溶液。主要解決了主流DNA回收方法時間長、經(jīng)濟(jì)成本高等問題。將DNA回收實(shí)驗(yàn)的操作時間壓縮至2min內(nèi)完成，單次回收成本降低到原來的1/10。不僅大大簡化操作流程，而且降低了時間成本和經(jīng)濟(jì)成本。
【IPC分類】C12N15/10
【公開號】CN105420228
【申請?zhí)枴緾N201610007547
【發(fā)明人】蒲小龍, 郭志雄, 潘東明, 潘騰飛, 葉如夢
【申請人】福建農(nóng)林大學(xué)
【公開日】2016年3月23日
【申請日】2016年1月7日