花青苷調(diào)控基因PyMYB10.2及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種植物花青苷調(diào)控基因PyMYBlO. 2及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花青苷是一類水溶性類黃酮物質(zhì)，廣泛存在于植物中，是葉、花和果實(shí)呈色的主要 色素成分。花青苷對植物本身具有重要的生理作用，可以提升植物對鹽脅迫、干旱脅迫和紫 外線脅迫的抗性;花瓣和果實(shí)中的花青苷可以吸引動物進(jìn)行授粉和種子傳播。除此之外，花 青苷還具有重要的醫(yī)療保健功能，可以改善肝功能、預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化和 保護(hù)視力等。因此，對花青苷的相關(guān)研究，尤其是花青苷的合成調(diào)控研究引起了人們極大的 關(guān)注，也是目前研究的一個熱點(diǎn)。
[0003] 花青苷合成途徑是植物中研究最為清楚的次生代謝途徑。參與花青苷合成的基因 分為結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因兩大類。其中，結(jié)構(gòu)基因編碼花青苷合成酶，調(diào)控基因編碼花青苷 調(diào)控蛋白。越來越多的研究表明花青苷的合成主要受轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，花青苷結(jié)構(gòu)基因之 間的表達(dá)存在一定的協(xié)同效應(yīng)，其表達(dá)強(qiáng)度和模式受調(diào)控基因的控制。由此可見，調(diào)控基因 在花青苷合成中發(fā)揮十分關(guān)鍵的作用。因此，發(fā)掘和鑒定花青苷調(diào)控基因，開展花青苷調(diào)控 基因克隆和作用機(jī)理等方面的研究，對實(shí)現(xiàn)植物花青苷含量的定向改良，具有十分重要的 理論意義和應(yīng)用價值。
[0004] MYB是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)含有MYB結(jié)構(gòu)域的個數(shù)，可以將其分為R1-MYB，R2R3-MYB和R1R2R3-MYB三類。其中R2R3-MYB是植物中數(shù)目最多的一類MYB轉(zhuǎn)錄因子，它 們在植物生命活動中發(fā)揮重要的作用，如調(diào)控細(xì)胞分化、形態(tài)建成、環(huán)境應(yīng)答和次生代謝 等。自從1987年P(guān)az-Ares首次報道玉米花青苷調(diào)控R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子C1以來，相繼從擬南 芥、蘋果、葡萄等十幾種植物中克隆鑒定了花青苷調(diào)控R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)這些轉(zhuǎn)錄因 子可以單獨(dú)或與bHLH、WD40形成蛋白復(fù)合體共同控制結(jié)構(gòu)基因的時空表達(dá)，在花青苷合成 調(diào)控中起中心作用。通過基因工程手段，已經(jīng)將花青苷調(diào)控R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子成功應(yīng)用于 改良花色，提升蔬菜水果中花青苷的含量等作物育種領(lǐng)域。另外，這類基因還可以作為植物 遺傳轉(zhuǎn)化的報告基因加以利用。
[0005] 富含花青苷的紅梨資源稀少珍貴，鑒于花青苷在呈色和營養(yǎng)保健上的重要功能， 近幾年人們提出了梨花青苷含量改良的育種目標(biāo)。隨著國內(nèi)外紅梨新品種的選育和推廣， 人們開始了梨花青苷合成調(diào)控的基礎(chǔ)生物學(xué)研究。但是，R2R3-MYB類花青苷調(diào)控基因在梨 中的研究還比較少，對該類基因進(jìn)行挖掘，研究其花青苷調(diào)控機(jī)理，有利于了解梨花青苷合 成調(diào)控的分子基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種花青苷調(diào)控基因PyMYBlO. 2,以及其在調(diào)控植物花青苷 合成中的應(yīng)用。本發(fā)明所提供的花青苷調(diào)控基因來源于梨(Pyrusspp)，具體品種為"早紅 酥"，克隆到的基因命名為PyMYB10.2。本發(fā)明包括（1)克隆一個花青苷調(diào)控基因PyMYB10.2; (2)提供該基因及其編碼蛋白的序列；（3)提供將該基因轉(zhuǎn)入煙草或擬南芥中的轉(zhuǎn)基因方 法；（4)提供該基因在調(diào)控植物花青苷合成中的應(yīng)用。
[0007] 一種花青苷調(diào)控基因PyMYB10.2,所述調(diào)控基因的核苷酸序列如SEQIDN0:1所 不。
[0008] 應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域人員可根據(jù)本發(fā)明公開的花青苷調(diào)控基因PyMYBlO. 2的核苷酸 序列（SEQIDN0:1)，在保證其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸，得 到該基因的突變序列。因此，本發(fā)明的花青苷調(diào)控基因PyMYBlO.2還包括SEQIDNO: 1所示 的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸殘基，具有與花青苷調(diào)控基因 PyMYB10.2編碼的蛋白相同活性的由PyMYB10.2衍生得到的基因。SEQIDNO: 1所示的核苷 酸序列是由855個核苷酸組成的基因。
[0009]本發(fā)明還提供上述編碼權(quán)利要求所述的PyMYBlO. 2基因編碼的蛋白。所述蛋白的 氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0010] SEQIDN0:2所示的氨基酸序列是由284個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
[0011] 含有權(quán)利要求1所述基因的重組質(zhì)粒。
[0012] 可選的，如上所述的重組質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為pMD18-T、pBI121或pGreenII62-SK。
[0013] 本發(fā)明的一個實(shí)施例中，將核苷酸序列為SEQIDNO: 1的基因片段鏈接到克隆載 體PMD-18T中；再通過限制酶剪切并連接到表達(dá)載體pBI121中構(gòu)建重組質(zhì)粒。
[0014]含有權(quán)利要求3或4所述重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞。
[0015]可選的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌和農(nóng)桿菌GV3101。
[0016]-種將權(quán)利要求1中所述基因轉(zhuǎn)入煙草中的轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：
[0017] 1)、提取梨總基因組DNA作為模板，以SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示核苷酸序列 的引物進(jìn)行擴(kuò)增；
[0018] 2)、將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并將核苷酸序列為SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆 到pGreenII62-SK上，得到重組質(zhì)粒；
[0019] 3)、將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101后用所述農(nóng)桿菌GV3101對煙草進(jìn)行侵染 轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因煙草。
[0020] -種將權(quán)利要求1中所述基因轉(zhuǎn)入擬南芥中的轉(zhuǎn)基因方法，包括以下步驟：
[0021] 1)、提取梨總基因組DNA作為模板，以SEQIDN0:3、SEQIDN0:4所示核苷酸序列 的引物進(jìn)行擴(kuò)增；
[0022]2)、將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并將核苷酸序列為SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆 到PBI121上，得到重組質(zhì)粒；
[0023]3)、將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，隨后用所述農(nóng)桿菌GV3101對擬南芥 進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)基因擬南芥。
[0024]可選的，如上所述的擬南芥轉(zhuǎn)基因方法，步驟2)具體包括：
[0025]將擴(kuò)增PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化并將核苷酸序列為SEQIDNO: 1的基因片段定向克隆到PMD18-T克隆載體中，對所述克隆載體進(jìn)行擴(kuò)增;將PyMYBlO. 2基因片段從克隆載體上酶切 下來，連接到經(jīng)過相同限制性內(nèi)切酶切割的表達(dá)載體PBI121上，得到重組質(zhì)粒。
[0026]本申請先將目的片段連接到克隆載體上，再酶切并與表達(dá)載體連接。此操作有主 要兩方面的原因：
[0027]進(jìn)克隆載體比進(jìn)表達(dá)載體容易很多，可以盡快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或 者因?yàn)門aq酶的錯配出現(xiàn)了堿基突變，會需要重復(fù)幾次，樣本即耗材都會大量消耗；
[0028]克隆載體的最大優(yōu)點(diǎn)是它一般都有成熟的篩選系統(tǒng)，這樣在一些連接效率較低、 特異性不強(qiáng)的時候容易篩選。
[0029]同時可選的，對所述克隆載體進(jìn)行擴(kuò)增時，所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌DH5a。
[0030] 權(quán)利要求1所述的基因在調(diào)控植物花青苷合成中的應(yīng)用。
[0031] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，基于此應(yīng)用可拓展出其他應(yīng)用，如開展花青苷調(diào)控基因克 隆和作用機(jī)理等方面的研究，對實(shí)現(xiàn)植物花青苷含量的定向改良、改良花色、提升蔬菜水果 中花青苷的含量、作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的報告基因等等。
[0032]所述植物可以為煙草和擬南芥，但本申請所述的應(yīng)用范圍包括不僅限于這兩種植 物。
[0033] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0034] 1)、R2R3_MYB類花青苷調(diào)控基因在梨中的研究還比較少，本發(fā)明提供了一種植物 花青苷調(diào)控基因PyMYBlO. 2，該基因與已知調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的同源性均低于50%，和bHLH轉(zhuǎn)錄 因子在調(diào)控花青苷結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)過程中存在協(xié)同效應(yīng)，可為相關(guān)研究提供新的思路。
[0035] 2)、本申請?zhí)峁┑膽?yīng)用在關(guān)于花青苷的科研和農(nóng)業(yè)研究中具有深入挖掘的前景。 可在本申請?zhí)峁┑霓D(zhuǎn)基因方法和應(yīng)用的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行改良花色、作為植物遺傳轉(zhuǎn)化 的報告基因、提升蔬菜水果中花青苷的含量等應(yīng)用。大大增加了花青苷的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0036] 圖1為構(gòu)建的PyMYB10.2與其它R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化樹；
[0037]圖2為PyMYB10.2對花青苷結(jié)構(gòu)基因AtDFR啟動子的調(diào)控活性的統(tǒng)計結(jié)果，縱坐標(biāo) 為焚火蟲焚光素酶(firefly luc if erase)和海腎螢光素酶(reni 11a lucif erase)活性比 值；
[0038]圖3為瞬時表達(dá)煙草的表型觀察示意圖；葉片上的深灰色斑點(diǎn)為侵染激活載體農(nóng) 桿菌的煙草溫室培養(yǎng)8天后形成的大量花青苷積累。
【具體實(shí)施方式】
[0039]下面將結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，