基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富虻闹谱鞣椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚣捌浠蚱我约霸摶蚱蔚膁sRNA與dsRNA在影響害蟲發(fā)育過程中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在我國，化學(xué)藥劑連續(xù)單一長期使用已導(dǎo)致昆蟲對多種農(nóng)藥產(chǎn)生了不同程度的抗性，需要不斷加大農(nóng)藥使用量才能達(dá)到滿意的防治效果，造成了更為嚴(yán)重的環(huán)境污染，形成惡性循環(huán)。另外舞毒蛾還會影響人類健康，當(dāng)人們直接接觸舞毒蛾時，常會發(fā)生紅腫發(fā)癢現(xiàn)象，嚴(yán)重者甚至產(chǎn)生皮疹。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中，急需化學(xué)農(nóng)藥之外的替代防治手段。
[0003]RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一種由雙鏈RNA介導(dǎo)的基因沉默現(xiàn)象，雙鏈RNA最終被加工大小約為22nt的小RNA(siRNA)，通過序列配對的方式與蛋白編碼基因結(jié)合，根據(jù)序列配對的程度降解靶標(biāo)基因mRNA或抑制基因的蛋白翻譯過程。RNAi廣泛地存在于真菌、植物和動物中。2006年Andre Fire和Craig Mello因發(fā)現(xiàn)RNAi現(xiàn)象被授予諾貝爾醫(yī)學(xué)與生理獎。
[0004]在生物體中，一些重要的基因?qū)S持生命是必須的。因此，從理論上而言，如果利用RNA干擾技術(shù)將農(nóng)業(yè)害蟲中重要基因的表達(dá)進(jìn)行干擾，則會引起害蟲的致畸或致死，從而達(dá)到控制害蟲的目的。
[0005]幾丁質(zhì)降解和代謝是昆蟲等節(jié)肢動物體內(nèi)特有的生物學(xué)現(xiàn)象，由于人類和其他高等動物體內(nèi)不含幾丁質(zhì)，因此昆蟲幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)已被公認(rèn)為新型殺蟲劑作用的靶標(biāo)。幾丁質(zhì)脫乙?；冈诶ハx幾丁質(zhì)的降解過程中起著關(guān)鍵作用，采用RNA干擾技術(shù)，開展幾丁質(zhì)脫乙酰基酶dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明旨在提供一種基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因及其基因片段以及該基因片段的dsRNA與dsRNA在影響害蟲發(fā)育過程中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富騆dCdal，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。所述LdCdal基因是從舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出的，其長度為1134bp，編碼378個氨基酸。
[0008]另外，本發(fā)明提供了一種舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因片段LdCda2，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009]進(jìn)一步，本發(fā)明提供了上述舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的合成方法，其步驟為:根據(jù)所述LdCdal的核苷酸序列，以序列SEQ ID N0.3為上游引物、序列SEQ IDN0.4為下游引物，將LdCdal的重組pEASY_Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得LdCda2。
[0010]然后，本發(fā)明進(jìn)一步利用相關(guān)試劑盒合成dsRNA，并且提供了該dsRNA影響害蟲發(fā)育過程中的應(yīng)用:注射dsRNA到舞毒蛾體腔。結(jié)果表明:dsRNA可以特異性的沉默幾丁質(zhì)脫乙?；富虻膍RNA表達(dá)，舞毒蛾生長發(fā)育延緩。
[0011]本發(fā)明根據(jù)舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因LdCdal獲得了基因片段LdCda2，以及該基因片段LdCda2的dsRNA，利用dsRNA能夠能夠使昆蟲因變態(tài)過程中受阻而發(fā)育遲緩，有望減少農(nóng)藥的大量使用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)收益，具有市場應(yīng)用前景，為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供了新途徑。
【附圖說明】
[0012]圖1為采用實時熒光定量PCR方法研究蛹期舞毒蛾幼蟲注射dsRNA后LdCdal的相對表達(dá)量。圖中:1表示對照組的蛹;2表示注射LdCdal的dsRNA的蛹。
【具體實施方式】
[0013]實施例1:舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的獲得
根據(jù)從舞毒蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富騆dCdal的核苷酸序列，采用primerpremier5.0軟件設(shè)計特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID N0.3，下游引物序列為SEQ ID N0.4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。將成功獲得的舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富騆dCda 1的重組pEASY-T 1質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得舞毒蛾幾丁質(zhì)酶基因片段LdCda2，使用MicroElute Cycle Pure Kit(OMEGA)試劑盒進(jìn)行純化。
[0014]實施例2:舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的dsRNA的獲得
用實施例1獲得的幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因片段LdCda2，按照T7RiboMAX? ExpressRNAi System(Promega)試劑盒說明書，體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其單一性，用酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan GO,Thermo Fisher5(^6社1打(3，1^4)檢測其濃度，并濃縮至終濃度11^/111保存至-80°(3備用。
[0015]實施例3:舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的dsRNA的舞毒蛾實驗 1)舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的dsRNA注射
選取蛹期幼蟲用于注射上述合成的dsRNAdul規(guī)格的微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，側(cè)腹部作為注射點(diǎn)，注意避開氣門。注射dsRNA的量為5 yg，并設(shè)置注射等量的DEPC處理的水的對照組，實驗組和對照組各20頭。注射完畢后，將幼蟲放置于生化培養(yǎng)箱中用購自中國林科院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所業(yè)進(jìn)行飼養(yǎng)(光照:黑暗時間=16h:8h，溫度26±1°C，濕度 70%)。
[0016]2)注入dsRNA后舞毒蛾表型的觀察幼蟲注射完畢后繼續(xù)飼養(yǎng)，并及時地觀察。
[0017]3)注入dsRNA后舞毒蛾發(fā)育過程的觀察
注射dsRNA的舞毒蛾實驗組蛹期幼蟲蛻變?yōu)槲瓒径瓿上x的過程被延緩，通過使用實時熒光定量PCR方法研究表明注射dsRNA的舞毒蛾實驗組蛹期幼蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)脫乙?；富虻南鄬Ρ磉_(dá)量明顯降低。
【主權(quán)項】
1.舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富騆dCdal，其核苷酸序列如SEQID N0.1所示。2.舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示。3.權(quán)利要求2所述舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的合成方法，其特征在于，其步驟為:根據(jù)權(quán)利要求1所述LdCdal的核苷酸序列，以序列SEQ ID N0.3為上游引物、序列SEQ ID N0.4為下游引物，將LdCdal的重組pEASY-Tl質(zhì)粒做為模板，PCR擴(kuò)增獲得LdCda2。4.權(quán)利要求2所述舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚱蜭dCda2的dsRNA。5.權(quán)利要求4所述舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙酰基酶基因片段LdCda2的dsRNA在影響害蟲發(fā)育過程中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種基于基因沉默技術(shù)的舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富蚣捌浠蚱我约霸摶蚱蔚膁sRNA與dsRNA在影響害蟲發(fā)育過程中的應(yīng)用。本發(fā)明根據(jù)舞毒蛾幾丁質(zhì)脫乙?；富?lt;i>Ld</i>Cda1獲得了基因片段<i>Ld</i>Cda2，以及該基因片段<i>Ld</i>Cda2的dsRNA，利用dsRNA能夠使昆蟲因變態(tài)過程中受阻而發(fā)育遲緩，有望減少農(nóng)藥的大量使用，保護(hù)環(huán)境，降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)收益，具有市場應(yīng)用前景，為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供了新途徑。
【IPC分類】C12N15/55, A01P7/04, C12N15/10, C12N15/113, A01N57/16
【公開號】CN105462996
【申請?zhí)枴緾N201510975016
【發(fā)明人】范曉軍, 趙秋勇, 李瑤, 糜艷霞, 楊春
【申請人】太原理工大學(xué)
【公開日】2016年4月6日
【申請日】2015年12月23日