用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的高細胞密度補料-分批發(fā)酵方法
【專利說明】
[00011本申請是申請日為2007年7月21日、申請?zhí)枮?00780027778.X、發(fā)明名稱為"用于 生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的高細胞密度補料-分批發(fā)酵方法"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請交叉參考案
[0003]本申請案主張2006年7月27日申請且名為用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的高細胞密度補 料-分批發(fā)酵方法（HIGH-CELLDENSITYFED-BATCHFERMENTATIONPROCESSFOR PRODUCINGRECOMBINANTPROTEIN)的美國臨時專利申請案第60/833.479號的優(yōu)先權(quán)，其全 部揭示內(nèi)容均以引用方式并入本文中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004]概括來說，本申請案是關(guān)于可提高細菌系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)表達的新穎補料-分批發(fā) 酵方法，以及高密度蛋白質(zhì)組合物和所述新穎補料-分批發(fā)酵方法中所用的組合物。
【背景技術(shù)】
[0005]已利用多種發(fā)酵策略來生產(chǎn)供實驗室、臨床或商業(yè)使用的足量蛋白質(zhì)。利用補料-分批發(fā)酵所提供的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比通過簡單分批發(fā)酵方法所提供的產(chǎn)量高。補料-分批發(fā)酵 方法在最初分批階段后進行將一或多種營養(yǎng)物通過補加補充到培養(yǎng)物中的階段。
[0006] 通常，在分批階段期間，細胞最初生長到期望濃度。在此階段，細胞生長旺盛且通 常不產(chǎn)生靶蛋白質(zhì)，除非我們視啟動子添加諸如阿拉伯糖、乳糖或異丙基β-D-硫代半乳糖 苷（IPTG)等誘導(dǎo)物或啟動子有些泄漏。在補料期期間，通常將碳源和其它必需物質(zhì)以相對 濃縮的液體流形式以一定補料速度補加到發(fā)酵罐中。在達到目標細胞密度后，開始補加誘 導(dǎo)物或誘導(dǎo)物和其它營養(yǎng)物。在此階段期間，重點是由所培育的細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)。補加到發(fā) 酵罐中的底物（即，營養(yǎng)物和誘導(dǎo)物)在此階段通常用于細胞生長和產(chǎn)物合成。通過補料速 度來控制細胞生長以獲得最佳細胞生長和蛋白質(zhì)產(chǎn)生。在蛋白質(zhì)產(chǎn)生階段期間，必須為重 組生物體添加誘導(dǎo)物。
[0007]在于補料期結(jié)束時出現(xiàn)限制條件以前包含常見碳源(例如葡萄糖或另一種基于糖 的碳源)和誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上的蛋白質(zhì)表達令人滿意。限制條件的實例包括生長培養(yǎng)基中 的氧濃度降低、諸如維生素、碳、氮等營養(yǎng)物減少和累積毒性化合物。
[0008]補料-分批發(fā)酵策略通常涉及不同反饋控制形式，包括控制營養(yǎng)物補充的間接和 直接反饋。一種所述補料-分批發(fā)酵方法涉及應(yīng)用通過補加營養(yǎng)物以將過程參數(shù)控制在規(guī) 定設(shè)定點的反饋控制算法。例如，補料的直接控制可基于營養(yǎng)物濃度的量度。隨后在整個發(fā) 酵期間反饋控制與細胞活性直接相關(guān)。已用于發(fā)酵反饋控制的控制參數(shù)包括pH值、在線測 量的細胞密度或溶解氧張力(DOT)。
[0009]然而，應(yīng)用反饋算法會伴隨許多缺點。一個所述缺點是補料速度依賴于當前的過 程參數(shù)。對過程的任何干擾都可能影響參數(shù)，由此歪曲補料速度和所得蛋白質(zhì)產(chǎn)量。當將所 述方法按比例放大以生產(chǎn)增量蛋白質(zhì)時，所述缺點被擴大。
[0010] 先前所用補料-分批策略的另一個缺點是當使用反饋控制時，不能準確地預(yù)先確 定或控制具體生長速度，導(dǎo)致在產(chǎn)物形成依賴于生長的情況下方法產(chǎn)量達不到最佳。
[0011] 此外，當進入到中心代謝途徑中的碳通量(例如，高葡萄糖濃度)超過三羧酸(TCA) 循環(huán)的最大容量后，可能累積副產(chǎn)物。副產(chǎn)物累積可能抑制發(fā)酵期間的細胞生長和蛋白質(zhì) 產(chǎn)生。
[0012] 另外，補料-分批發(fā)酵方法的所述多個缺陷通常會導(dǎo)致營養(yǎng)物組份利用效率低。因 此，這些方法在經(jīng)濟上不利，尤其在大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)時。
[0013]如上所述，通過補料-分批發(fā)酵表達重組蛋白質(zhì)的先前途徑具有多個缺陷?？紤]到 以成本有效方式生產(chǎn)用于各種用途的足量蛋白質(zhì)的重要性，當前需要可達成較高細胞生 長、增多的產(chǎn)物形成（即，蛋白質(zhì)產(chǎn)量較高）和較少的副產(chǎn)物累積的有效補料-分批發(fā)酵方 法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明是關(guān)于可達成出乎意料高的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量的新穎補料-分批發(fā)酵方法。
[0015]本發(fā)明實施例提供生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含:培養(yǎng)表達重組蛋白質(zhì)的重組 細菌細胞，此包含向包含重組細菌細胞的培養(yǎng)物中連續(xù)添加碳源并在培養(yǎng)物達到閾值參數(shù) 后向培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導(dǎo)物;和自細胞培養(yǎng)物中分離重組蛋白質(zhì)。
[0016]本發(fā)明的又一實施例提供生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含：（a)在誘導(dǎo)型啟動子控 制下將編碼重組蛋白質(zhì)的表達載體引入到細菌宿主細胞中以形成重組細菌細胞；（b)將所 述重組細菌細胞引入到培養(yǎng)基中以形成細胞培養(yǎng)物；（c)將碳源以連續(xù)補料形式添加到細 胞培養(yǎng)物中；（d)監(jiān)測細胞培養(yǎng)物中的細胞生長是否達到閾值光密度(0D6QQ); (e)在達到閾 值光密度(〇D_)后，將誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)物以連續(xù)補料形式添加到細胞培養(yǎng)物中；和(f) 自細胞培養(yǎng)物收獲重組蛋白質(zhì)。
[0017]本發(fā)明的再一實施例提供生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包含:培養(yǎng)表達重組蛋白質(zhì) 的重組細菌細胞，其是通過在包含所述細菌細胞的培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向所述培養(yǎng)物中 連續(xù)添加誘導(dǎo)物來培養(yǎng)，其中所述細菌細胞包含對應(yīng)于腦膜炎奈瑟菌血清群B (N.meningitidisserogroupB)基因的核酸序列。
[0018]根據(jù)再一實施例，本發(fā)明提供生產(chǎn)重組2086蛋白質(zhì)（rP2086)的方法，其包含：（a) 在誘導(dǎo)型啟動子控制下將編碼重組腦膜炎球菌(meningococcal)2086蛋白質(zhì)的表達載體引 入到細菌宿主細胞中以形成重組細菌細胞；（b)將所述重組細菌細胞引入到培養(yǎng)基中以形 成培養(yǎng)物；（c)向培養(yǎng)物中添加碳源；（d)監(jiān)測培養(yǎng)物中的細胞生長是否達到閾值光密度 (0D);(e)在培養(yǎng)物的細胞密度達到約70至110的光密度后，向培養(yǎng)物中連續(xù)添加誘導(dǎo)型啟 動子的誘導(dǎo)物;和(f)在開始連續(xù)添加誘導(dǎo)物后約3小時至約6小時后，自培養(yǎng)物收獲重組腦 膜炎球菌2086蛋白質(zhì)。
[0019]根據(jù)另一實施例，本發(fā)明提供一種包含細菌培養(yǎng)物的組合物，所述細菌培養(yǎng)物包 含基于細菌培養(yǎng)物的總體積，密度為至少約1.5g/L的重組2086蛋白質(zhì)(rP2086)。
[0020] 根據(jù)再一實施例，本發(fā)明提供一種包含細菌培養(yǎng)基的組合物，所述細菌培養(yǎng)基包 含按照本發(fā)明方法所制備的重組腦膜炎球菌2086蛋白質(zhì)(rP2086)。
【附圖說明】
[0021 ]圖1:無誘導(dǎo)時不同恒定補料速度下的補料-分批發(fā)酵。
[0022] 圖2:無誘導(dǎo)時不同恒定補料速度下的補料-分批發(fā)酵。
[0023]圖3:在不同光密度下進行誘導(dǎo)。
[0024]圖4:用不同量的阿拉伯糖進行誘導(dǎo)。
[0025]圖5:阿拉伯糖添加方法對rLP2086產(chǎn)量的影響。
[0026]圖6:阿拉伯糖補料速度對rLP2086產(chǎn)量的影響。
[0027]圖7:誘導(dǎo)時間對表達的影響。
[0028] 圖8:用于生產(chǎn)亞科BrLP2086的補料-分批發(fā)酵。
[0029]圖9a和9b:分別為rLP2086亞科B誘導(dǎo)的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)。
[0030] 圖10:用于生產(chǎn)亞科ArLP2086的補料-分批發(fā)酵。
[0031] 圖11a和lib:分別為rLP2086亞科A誘導(dǎo)的SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。
[0032]圖12a、12b和12c:在誘導(dǎo)期間雙重補加葡萄糖和阿拉伯糖。
[0033] 圖13a: 100L規(guī)模的rLP2086亞科B大腸桿菌補料-分批發(fā)酵。
[0034] 圖13b: 100L規(guī)模的rLP2086亞科A大腸桿菌補料-分批發(fā)酵。
[0035]圖14a: 100L規(guī)模的葡萄糖和阿拉伯糖雙重補料的rLP2086亞科B大腸桿菌補料-分 批發(fā)酵。
[0036]圖14b:100L規(guī)模的葡萄糖和阿拉伯糖雙重補料的rLP2086亞科A大腸桿菌補料-分 批發(fā)酵。
【具體實施方式】
[0037]本發(fā)明方法是基于以下驚人發(fā)現(xiàn):通過在誘導(dǎo)期間向培養(yǎng)基中連續(xù)補加誘導(dǎo)物的 補料-分批發(fā)酵可獲得出人意料高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。任選地，碳源是在連續(xù)誘導(dǎo)物補料之前 和/或期間連續(xù)補加。當由阿拉伯糖誘導(dǎo)時，按照本發(fā)明實施例可產(chǎn)生約2_3g/L的重組2086 脂蛋白（rLP2086)(其由具有對應(yīng)于腦膜炎奈瑟菌血清群B中的2086基因的序列的微生物所 表達）。此表示與相當分批發(fā)酵方法相比通過補料-分批發(fā)酵2086蛋白質(zhì)的亞科A和B二者的 rLP2086產(chǎn)量均有2-3倍增加。而且，本發(fā)明方法可容易地適應(yīng)所述和其它蛋白質(zhì)的商業(yè)規(guī) 模生產(chǎn)。
[0038]為促進對本文所述實施例的理解，可參考多個實施例且將使用特定語言來闡述 其。本文所用的術(shù)語僅用于闡述具體實施例，而不意欲限制本發(fā)明的范圍。除非上下文另外 明確說明，否則在整篇揭示內(nèi)容中所用的單數(shù)形式"一"和"所述"包括多個指示物。同樣，諸 如"培養(yǎng)基(medium)"等術(shù)語的單數(shù)形式包括"培養(yǎng)基"的復(fù)數(shù)形式指示物，且反之亦然。因 此，例如，"培養(yǎng)基(culturemedium)"指示物包括多種所述培養(yǎng)基以及單一培養(yǎng)基;且"培 養(yǎng)基"指示物包括多種培養(yǎng)基以及單一培養(yǎng)基。
[0039]本文所用的術(shù)語"誘導(dǎo)物"是指可誘導(dǎo)、增強或促進重組蛋白質(zhì)表達的任何試劑， 由此在誘導(dǎo)型啟動子控制下的基因表達可由所述試劑的濃度直接調(diào)節(jié)。
[0040]本文所用的術(shù)語"碳源"是指用于細胞的碳和能量來源。
[0041]術(shù)語"補料(feed)"、"補料(fed)"、"補加（feeding)"或"連續(xù)添加"在本文中可交 換使用，其是指經(jīng)一段時間連續(xù)地而非同時添加物質(zhì)。此術(shù)語涵蓋在發(fā)酵過程期間用于連 續(xù)添加物質(zhì)的單個開始和/或終止或多個起點和/或終點。
[0042]本文所用的術(shù)語"重組蛋白質(zhì)"是指不為自編碼氨基酸的重組遺傳物質(zhì)所表達的 報道基因或標記基因（例如，綠色熒光蛋白）的任何蛋白質(zhì)或其生物活性部分(例如，保留完 整蛋白質(zhì)的生物活性的部分），其包括肽、多肽、蛋白質(zhì)、寡聚蛋白質(zhì)和/或融合蛋白質(zhì)。重組 蛋白質(zhì)產(chǎn)物可包括治療性、預(yù)防性或診斷性產(chǎn)物。
[0043]本發(fā)明方法：
[0044]本發(fā)明方法可通過涉及在培養(yǎng)物達到閾值參數(shù)后向培養(yǎng)基中連續(xù)添加誘導(dǎo)物(例 如阿拉伯糖)的新穎補料-分批發(fā)酵方法提供出人意料高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。通常在誘導(dǎo)期之前 將諸如葡萄糖等碳源添加到包含重組細菌細胞的培養(yǎng)物中。可將碳源與誘導(dǎo)物一起補加。 誘導(dǎo)物也可作為第二碳源。
[0045]按照本發(fā)明實施例，在向培養(yǎng)基中連續(xù)補加誘導(dǎo)物之前和/或期間向培養(yǎng)基中連 續(xù)添加諸如葡萄糖等碳源。因此，根據(jù)一實施例，連續(xù)補加碳源與連續(xù)補加誘導(dǎo)物交疊。連 續(xù)補加碳源可在連續(xù)補加誘導(dǎo)物的全部持續(xù)時間段期間或僅在所述持續(xù)時間段的一部分 期間繼續(xù)。在另一實施例中，連續(xù)補加碳源與連續(xù)補加誘導(dǎo)物不交疊。根據(jù)本發(fā)明一實施 例，可以恒定速度將誘導(dǎo)物和/或碳源補加到培養(yǎng)物中。
[0046] 按照本發(fā)明實施例，所述補料-分批發(fā)酵方法涉及可產(chǎn)生期望蛋白質(zhì)的數(shù)個步驟。 在起始步驟中，制備在誘導(dǎo)型啟動子控制下編碼重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的表達載體并隨后將其引 入到細菌宿主細胞中。將細菌宿主細胞引入到培養(yǎng)基中。將誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)物補加到 培養(yǎng)物中（即，將誘導(dǎo)物經(jīng)一段時間連續(xù)添加到培養(yǎng)物中）?？梢院愣ㄋ俣葘⒄T導(dǎo)物補加到 培養(yǎng)物中。隨后，自培養(yǎng)物收獲重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物。隨后可將以此方式產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)視需 要進行純化和/或以任何適宜方式(例如以預(yù)防性、治療性或診斷性調(diào)配物形式)使用。
[0047] 通過以恒定速度補加誘導(dǎo)物的補料-分批發(fā)酵可出乎意料地達成高細胞密度和增 加的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，如下文提供實例中所闡釋，與分批發(fā)酵相比所述補料-分批發(fā)酵使重組蛋 白質(zhì)產(chǎn)物的產(chǎn)量增加約2-3倍。本發(fā)明方法適于大規(guī)模發(fā)酵以及小規(guī)模發(fā)酵。本文所用的 "大規(guī)模"發(fā)酵是指在體積容量（即，工作體積)至少為約l，〇〇〇L的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，其中 已留出足夠的頂部空間。"小規(guī)模"發(fā)酵通常是指在體積容量通常不大于約100L(例如5L、 10U50L或100L)的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵。本發(fā)明補料-分批發(fā)酵方法的證實優(yōu)點是其可用于 以5-10L發(fā)酵罐規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物且可按比例縮放到任何體積，例如（但不限于） 100L、150L、250L、500L、1000L或更大。
[0048] 誘導(dǎo)物：
[0049] 本文所述方法是關(guān)于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，其中重組蛋白質(zhì)的表達是在誘導(dǎo)型啟動子 的轉(zhuǎn)錄控制下進行，由此在誘導(dǎo)型啟動子控制下的基因表達可由存在于培養(yǎng)基中的誘導(dǎo)物 的濃度直接調(diào)節(jié)。將誘導(dǎo)物任選地以恒定速度連續(xù)提供到培養(yǎng)基中