一種用于區(qū)分蘿卜品種的rapd引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用RAPD分子標記技術(shù)快速區(qū)分 蘿卜品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘿卜為起源于中國的一種世界性蔬菜，其栽培歷史悠久，品種資源及其豐富，2006 年以來全國年播種面積超過1200千公頃，位于所有蔬菜作物的前3位，在蔬菜生產(chǎn)與供應(yīng)中 占有重要地位。近些年來，隨著我國蘿卜產(chǎn)量及栽培面積的大幅度擴展，越來越多的優(yōu)良品 種應(yīng)用于蘿卜生產(chǎn)中。因此，建立蘿卜品種快速可靠的鑒定技術(shù)體系對于蘿卜品種遺傳資源的 研究保護、苗期鑒定、品種區(qū)分乃至蘿卜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展等具有重要的意義。
[0003] DNA分子標記是隨著分子克隆和重組DNA等生物技術(shù)迅速發(fā)展而產(chǎn)生的一類遺傳 標記，由于其直接建立在分子水平上，而不受外界環(huán)境、作物發(fā)育階段、取樣部位等因素影 響，其檢出的多態(tài)性位點是無限的，故鑒定結(jié)果具有高度的可靠性，且重復(fù)性高，鑒別力強。
[0004] 由于目前傳統(tǒng)單一的形態(tài)學(xué)品種鑒定方法已無法滿足有效鑒別或區(qū)分當(dāng)今日益 增多的品種的要求。分子標記的應(yīng)用給作物遺傳育種研究帶來了巨大變化，同時也應(yīng)用到 了品種鑒定的研究中。在常用的RAro、ISSR、SRAP和AFLP等眾多分子標記技術(shù)中，隨機擴增 多態(tài)性DNA(RandomAmplifiedPolymorphicDNAJAFO)基于PCR技術(shù)，是應(yīng)用較早的分子 標記技術(shù)之一，它以分析程序簡便快捷，周期性短，不易受外界環(huán)境影響，所需費用低，且無 需對基因組序列進行預(yù)知等優(yōu)點，已被普遍應(yīng)用于指紋圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)研 究、基因的快速定位、基因連鎖標記、遺傳多樣性分析，品種分類研究等方面。
[0005] 現(xiàn)有的利用RAro技術(shù)在進行蔬菜作物品種區(qū)分與種質(zhì)鑒定的研究工作中，多采用 計算機軟件繪制數(shù)字化指紋圖譜并結(jié)合統(tǒng)計學(xué)軟件聚類分析得出聚類樹，但是此聚類分析 結(jié)果不但無法直觀顯示出區(qū)分品種的引物，無法顯示鑒別過程，其操作量大，缺乏實用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是:提供一種利用RAro技術(shù)區(qū)分蘿卜品種的引物。
[0007] 本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是:提供利用上述引物區(qū)分蘿卜品種的應(yīng)用。
[0008] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0009] -種用于區(qū)分蘿卜品種的RAPD引物包括如下引物序列：
[0010] RP13:5 '-TATGTCTACTC-3 '；
[0011] RP102:5 '-CTAGGATTATT-3 '；
[0012] RP55:5 '-TATTATTGGCT-3 '；
[0013] RP271:5 '-ACGGTGCGGCG-3 '。
[0014]上述用于區(qū)分蘿卜品種的RAPD引物在區(qū)分蘿卜品種中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護范圍 之內(nèi)。
[0015] 利用上述RP13、RP102、RP55與RP271引物區(qū)分蘿卜品種的RAPD方法，包括如下步驟：
[0016] (1)提取蘿卜葉片基因組DNA;
[0017] (2)利用RP13引物對步驟（1)得到的基因組DNA進行RAPD擴增，得到的PCR產(chǎn)物用瓊 脂糖凝膠電泳檢測，若在1800bp、1200bp處都出現(xiàn)特征性譜帶，而在750bp無特征性譜帶，蘿 卜的品種為"滿身紅"；若在1800bp、1200bp、750bp處都出現(xiàn)特征性譜帶，蘿卜品種為"秋田揚 花"；
[0018] (3)若瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果與步驟(2)不符，則利用RP102引物再對基因組DNA 進行RAro擴增，
[0019] 若利用RP13引物擴增時，在1200bp處出現(xiàn)特征性譜帶，而在1800bp、750bp處未出 現(xiàn)特征性譜帶，RP102引物擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種:若在lOOObp未出現(xiàn)特征性譜 帶的，其品種為"秋田大紅袍"；若在l〇〇〇bp、150bp都出現(xiàn)特征性譜帶，而在400bp處未出現(xiàn) 特征性譜帶，其品種為"秋田滿堂紅"；若在1 〇〇〇bp、400bp、150bp處都出現(xiàn)特征性譜帶，其品 種為"南韓大根"；若在l〇〇〇bp、400bp都出現(xiàn)特征性譜帶，而在150bp未出現(xiàn)特征譜帶，則進 入步驟(4);若在400bp、150bp均未出現(xiàn)特征性譜帶，而在lOOObp出現(xiàn)特征譜帶，貝lj進入步驟 (5)；
[0020] 若利用RP13引物擴增時，若在1800bp處出現(xiàn)特征性譜帶，而在1200bp、750bp處未 出現(xiàn)特征性譜帶，利用引物RP102擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種:經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢 測在600bp、250bp均出現(xiàn)特征性譜帶，其品種為"西南紅帥"；若在600bp出現(xiàn)特征性譜帶，而 250bp未出現(xiàn)特征性譜帶，則進入步驟(6);
[0021] 若利用RP13引物擴增時，在1200bp、750bp處出現(xiàn)特征性譜帶，而在1800bp處未出 現(xiàn)特征性譜帶，利用引物RP102擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種:經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測 在100bp處出現(xiàn)特征性譜帶，而在1800bp、400bp處未初現(xiàn)特征譜帶的為品種"青皮甜帥"；若 在1800bp處出現(xiàn)特征性譜帶，而在400bp、100bp處未初現(xiàn)特征譜帶的為品種"翹頭青"；若在 1800bp、400bp均出現(xiàn)特征譜帶，而在100bp未出現(xiàn)特征譜帶，貝lj進入步驟(7);
[0022] (4)利用RP102引物進行RAPD擴增，若在1000bp、400bp都出現(xiàn)特征性譜帶，而在 150bp未出現(xiàn)特征譜帶，RP55引物擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種：
[0023] 若在lOOObp出現(xiàn)特征性譜帶的，其品種為"短葉十三"；若在250bp出現(xiàn)特征性譜帶 的，其品種為"銀魅"；若在3000bp、500bp均出現(xiàn)特征性譜帶的，其品種為"中秋紅"；
[0024] (5)利用RP102引物進行RAH)擴增，若在400bp、150bp均未出現(xiàn)特征性譜帶，而在 lOOObp出現(xiàn)特征譜帶，RP55引物進行RAH)擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種：
[0025] 若在lOOObp與200bp處均出現(xiàn)特征性譜帶的，其品種為"穿心紅"；在200bp未出現(xiàn) 特征性譜帶，其品種為"白玉春"；若在lOOObp處未出現(xiàn)特征譜帶，而在200bp處出現(xiàn)特征性 譜帶，則進入步驟(8);
[0026] (6)利用RP102引物進行RAH)擴增，若在600bp出現(xiàn)特征性譜帶，而250bp未出現(xiàn)特 征性譜帶，再用RP55引物進行RAH)擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種：
[0027] 若在1200bp出現(xiàn)特征性譜帶的，其品種為"綿陽紅"；在1200bp未出現(xiàn)特征性譜帶， 其品種為"揚州圓白"；
[0028] (7)利用RP102引物進行RATO擴增，若在1800bp、400bp均出現(xiàn)特征譜帶，而在100bp 未出現(xiàn)特征譜帶，RP55引物進行RAH)擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種：
[0029] 若在lOOObp和400bp均出現(xiàn)特征性譜帶的，其品種為"霸王青"；在1200bp出現(xiàn)特征 性譜帶，其品種為"豐秋青王"；在250bp出現(xiàn)特征性譜帶的品種為"韓玉春"；
[0030] (8)利用RP55引物進行RAro擴增，若在lOOObp處未出現(xiàn)特征譜帶，而在200bp處出 現(xiàn)特征性譜帶，RP271引物進行RAH)擴增后使用如下方法判斷蘿卜品種：
[0031 ] 若在400bp出現(xiàn)特征性譜帶的為品種"七葉圓紅"；若在400bp未出現(xiàn)特征譜帶的為 品種"浙大長"。
[0032]其中，步驟(1)提取蘿卜葉片基因組DNA的方法如下：
[0033] 取蘿卜幼嫩葉片0.2g，經(jīng)液氮研磨，加入500μ1CTAB裂解液，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中， 65°C水浴0.5~lh后取出冷卻，加入等體積的氯仿/異戊醇混合物后輕輕搖晃，12000r/min， 離心8~lOmin，上清液用氯仿/異戊醇混合物抽提1~2次，加入預(yù)冷異丙醇，在4°C條件下靜 置3小時以上，收集絮狀DNA用體積分數(shù)為70 %的乙醇洗滌，干燥后將絮狀DNA溶于TE緩沖液 中保存；
[0034] 其中，所述的CTAB裂解液的組成如下：體積分數(shù)為2%CTAB，2mol/LNaCl2,20m mol/LEDTA，100mmol/LTris-HCl，PH=8.0，體積分數(shù)為0.2%β-巰基乙醇;所述的氯仿/異 戊醇混合物中氯仿與異戊醇的體積比為24:1。
[0035] 其中，所述的RAPD擴增，其PCR反應(yīng)體系為20μ1，其中含50ng基因組DNA，MgCl22.0mmol·L-SdNTPs0.15mmol·L-S引物0·44μπιο1 ·L-STaqDNA聚合酶0.75U。
[0036] 其中，所述的RAPD擴增，其PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性2min; 94°C變性30S，退火 45S，72°C延伸90S，42個循環(huán)；72°C延伸10min，后于4°C保存；其中RP13引物的退火溫度為 43.5°C，RP102的退火溫度為42.3°C，RP55的退火溫度為39.4°C，RP271的退火溫度為41.6 V。
[0037] 在PCR擴增儀上進行擴增，擴增產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染 色，紫外投射儀觀察拍照得到擴增譜帶。
[0038]本發(fā)明通過4個引物就能區(qū)分出20個不同蘿卜品種，為了清晰、完整地表示鑒別采 用的引物和鑒別出的品種，同時為了方便他人對蘿卜品種進行區(qū)分、鑒定，本發(fā)明還人工繪 制了 "樹型植物品種鑒定圖"。通過樹形圖表示各個品種區(qū)分的過程及相應(yīng)品種，通過標記 引物名稱和譜帶的有無表示品種的鑒定方法和判斷依據(jù)。本發(fā)明