一種與致病力相關(guān)的灰霉病菌基因BcAtm1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬微生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物保護(hù)領(lǐng)域中控制真菌致病性的 基因及其編碼蛋白質(zhì)的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 灰霉病菌(Botrytis cinerea)通常又稱作灰葡萄孢，屬于子囊菌門（Ascomycota) 真菌，是灰霉病的病原菌，可侵染200多種植物，包括幾乎所有的蔬菜及果樹。寄主從苗期、 掛果期到貯存期均可發(fā)病，而且，植株各部位均可被灰霉病菌侵染，葉部發(fā)病的典型癥狀表 現(xiàn)為"V"形病斑，花部主要表現(xiàn)為腐爛和調(diào)萎，果實(shí)主要表現(xiàn)為腐爛和脫落。病害的發(fā)生和 蔓延與環(huán)境的濕度、溫度存在密切的關(guān)系，在20°C_23°C，相對濕度90%以上時發(fā)生嚴(yán)重。因 此，灰霉病屬低溫高濕型病害，在多雨季節(jié)或者保護(hù)地生產(chǎn)中極易發(fā)生，世界上每年因該病 導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)100-1000億美元。由于寄主范圍廣泛，生產(chǎn)上危害嚴(yán)重，再加上相關(guān)分 子研究技術(shù)成熟，灰霉病菌已成為最重要的模式植物病原真菌之一，受到廣泛研究。
[0003] 灰霉病菌是典型的死體營養(yǎng)型病原真菌，可生成多種致病因子參與致病，主要包 括細(xì)胞壁降解酶類、角質(zhì)酶、毒素、植物激素、抵抗寄主反應(yīng)的酶類、小RNA及小分子物質(zhì)等， 這些因子相互協(xié)作使灰霉病菌能夠殺死寄主細(xì)胞，并分解死亡的寄主組織作為營養(yǎng)。自然 條件下，灰霉菌多以分生孢子作為侵染寄主的初侵染和再侵染來源。灰霉病菌常以菌絲體、 分生孢子或菌核附著在植物病殘?bào)w上，或在土壤中越冬和越夏，成為下一生長季的初侵染 來源。當(dāng)條件適宜時，菌核萌發(fā)產(chǎn)生菌絲體和分生孢子梗，并產(chǎn)生大量的分生孢子。成熟的 分生孢子能夠借助風(fēng)、雨水、灌概水和農(nóng)事操作等進(jìn)行傳播。在低溫高濕條件下，分生孢子 萌發(fā)形成芽管，芽管末端稍稍膨大發(fā)育成附著胞或者進(jìn)一步形成侵染墊等侵染結(jié)構(gòu)，主要 從衰敗的花器、傷口以及壞死組織侵入。
[0004] 當(dāng)高濃度的灰霉病菌分生孢子侵染寄主時，發(fā)病迅速，此時主要通過芽管頂端形 成的附著胞侵入;伴隨孢子濃度降低，通過芽管頂端侵入的比例降低，發(fā)病速度也相應(yīng)延緩 1-4天，此時主要通過由菌絲發(fā)育成的附著胞或侵染墊侵入?；颐共【秩爰闹骷?xì)胞后，將 會直接面臨寄主組織內(nèi)敵對環(huán)境的挑戰(zhàn)，病原菌必須迅速做出調(diào)整，一方面抑制植物的防 御反應(yīng)，另一方面要積極適應(yīng)寄主細(xì)胞內(nèi)物理、化學(xué)環(huán)境，做到這兩方面，灰霉病菌才有望 成功地寄生植物。在很大程度上，灰霉病菌是通過改變自身的代謝途徑，并分泌相關(guān)效應(yīng)因 子(如毒素)來實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)的，但參與相應(yīng)過程的基因、蛋白及代謝產(chǎn)物及其調(diào)控的分子 機(jī)制仍所知甚少。對該領(lǐng)域進(jìn)行深入研究，鑒定灰霉病菌用以適應(yīng)寄主內(nèi)環(huán)境的關(guān)鍵因子， 不僅有助于揭示灰霉病菌這種死體營養(yǎng)型病原真菌致病的分子機(jī)制，還有可能從中發(fā)現(xiàn)可 以作為殺真菌劑作用靶標(biāo)的蛋白質(zhì)，為開發(fā)防治灰霉病及其它類似病害的高效藥劑奠定理 論和技術(shù)基礎(chǔ)。
[0005] 灰霉病菌BcAtml是一種ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ATP-binding cassette transporter)， 其功能尚未獲得鑒定，通過分析BcAtml基因的致病功能，評價(jià)該基因在灰霉病菌發(fā)育及致 病過程的作用，有利于鑒定潛在的防治靶標(biāo)，用于篩選新型殺真菌藥劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的旨在提供一種控制菌絲生長及致病性的基因及其編碼的蛋白質(zhì)。
[0007] 本發(fā)明所提供的控制菌絲生長及致病性基因來源于灰霉病菌，名稱為BcAtml，其 DNA序列如SEQ ID No: 1所示。該DNA序列為BcAtml基因開放閱讀框，由2203個核苷酸組成， 其中包含2個外顯子，分別位于SEQ ID No: 1的5'端第1位至2062位核苷酸之間和第2118位 至2203位核苷酸之間，組成的編碼區(qū)長度合計(jì)為2148個核苷酸。
[0008] 本發(fā)明提供了BcAtml基因所編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID No: 2所示，該 序列由715個氨基酸組成。
[0009] 來自灰霉病菌的控制菌絲生長及致病性基因 BcAtml可應(yīng)用于植物抗灰霉病基因 工程領(lǐng)域。
[0010] 對來自灰霉病菌的控制菌絲生長及致病性基因 BcAtml所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行缺失、 突變或修飾，而使其致病力發(fā)生缺陷，可作為靶標(biāo)在設(shè)計(jì)和篩選抗真菌藥劑中應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明證明了BcAtml基因的缺失或突變，導(dǎo)致灰霉病菌致病力顯著降低，說明 BcAtml基因是灰霉病菌引起農(nóng)作物灰霉病所必需的基因。因此，篩選能夠阻止該基因表達(dá) 與其蛋白質(zhì)的表達(dá)、修飾及定位的化合物，可以有效控制灰霉病的發(fā)生，從而有助于開發(fā)新 型殺菌劑，即本發(fā)明所提供的BcAtml基因的一個重要用途是:該基因的表達(dá)與其編碼的蛋 白質(zhì)產(chǎn)物的表達(dá)、修飾及定位，可以作為重要候選靶標(biāo)位點(diǎn)，用于抗真菌藥劑(特別是抗灰 霉病菌藥劑)的設(shè)計(jì)和篩選。
【附圖說明】
[0012]圖1為BcAtml蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域分析示意圖 [0013]其中：Atml為一類ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；
[0014] 圖2為灰霉病菌BcAtml基因的敲除策略(通過同源重組進(jìn)行基因替換)示意圖
[0015] 其中：WT為野生型菌株B05.10，pAtml-ko為敲除載體，BcAtml-KO為BcAtml基因缺 失突變體，a、b、c、d為用于驗(yàn)證突變體及互補(bǔ)菌株的引物；
[0016]圖3為BcAtml基因缺失突變體及遺傳互補(bǔ)菌株的PCR驗(yàn)證電泳圖
[0017] 其中：a、b、c、d為所用引物，相應(yīng)位置見圖2;M1為BcAtml基因缺失突變體;Ml/Atml 為在突變體Ml基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)入完整BcAtml基因的互補(bǔ)菌株；
[0018] 圖4為BcAtml基因的缺失突變體與野生型菌株B05.10的培養(yǎng)特征對比照片
[0019] 其中:所用培養(yǎng)基為PDA，20°C培養(yǎng)，接種后3天觀察拍照；
[0020] 圖5為BcAtml基因的缺失突變體與野生型菌株及互補(bǔ)菌株的致病力比較照片
[0021] 其中:所選擇寄主為菜豆，采用離體葉片接種孢子的方法。接種3天后進(jìn)行評價(jià)；
[0022] 圖6為BcAtml基因的突變體與對照菌株侵染寄主所產(chǎn)生病斑大小的定量分析示意 圖
[0023] 其中：接種方法同上，接種3天后對葉片病斑面積進(jìn)行測量計(jì)算，換算成相對大 小。**表示在ρ〈0·01水平上差異顯著。
【具體實(shí)施方式】
[0024]為了更好地描述本發(fā)明，下面通過具體的實(shí)施例予以進(jìn)一步的說明，下述實(shí)施例 中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0025]實(shí)施例1 BcAtml基因的相關(guān)性分析
[0026] 灰霉病菌BcAtml基因的開放閱讀框由2203個核苷酸組成，包含2個外顯子，編碼區(qū) cDNA全長為2148個核苷酸，編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物由715個氨基酸組成，結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)， BcAtml蛋白質(zhì)包含一個ABC膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Atml (見圖1)。
[0027] 實(shí)施例2 BcAtml基因的敲除 [0028] 1)敲除載體的構(gòu)建
[0029] 與Atml-UP-R(5'-TTGGGTACCGAGCTCGAATTC GCTCTGGATAGCACTGCCTTT-3'），以灰霉病菌菌株 B05. 10的基因組DNA為模板擴(kuò)增BcAtml基因上游871bp片段，采用Atml-DN-F(5'-AAAGATCAAAGGATCGTCGAC GGAGAAGGGTCAAGAACAAGAAG-3')igAtml-DN-R(5'-CTTGCATGCCTGCAGGTCGAC GGAATAGTATAAGCTCCAAGGCAC-3 '）擴(kuò)增灰霉病菌BcAtml基因下游 683bp片段，反應(yīng)體系為：10mmol/L dNTP Mixture，0.5yL;10XPCR buffer，2.5yL;上下游 引物各lyL( 10ymo