一種檢測3′非翻譯區(qū)對mRNA翻譯效率的作用的方法
【技術領域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種在細胞中研究3'UTR對mRNA翻譯效率的作用的方法。
【背景技術】
[0002] 可選擇性多聚腺苷酸化(alternative polyadenylation，APA)在基因表達調(diào)控中 起著重要的作用。位于終止密碼子下游的APA可以產(chǎn)生具有不同長度3'UTR的mRNA異構體， 而不同長度的3'UTR可以導致順式調(diào)控元件的包含或缺失，這些順式調(diào)控元件包括RNA結合 蛋白（RNA binding protein,RBP)的結合位點和miRNA結合位點等，從而對mRNA的轉運、穩(wěn) 定性、翻譯效率等產(chǎn)生影響，進而對表型造成影響。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在不同的生理和細 胞狀態(tài)中存在全基因組3 ' UTR轉換現(xiàn)象，包括腫瘤發(fā)生和轉移、動物發(fā)育、免疫應答等。因 此，研究APA對基因表達調(diào)控的影響，對于揭示與APA相關疾病的致病機理、信號調(diào)控網(wǎng)路等 具有重要的意義。
[0003] 目前研究3'UTR長度與翻譯效率關系的方法主要有以下兩種：（1)運用熒光素酶報 告基因載體，將不同長度的3'UTR連接到熒光素酶報告基因載體上，通過檢測熒光素酶與底 物反應產(chǎn)生的熒光強度來間接反映基因的表達量，從而判斷3 ' UTR長度對翻譯效率的影響； (2)多聚核糖體密度梯度離心(polysome profi 1 ing)結合APA位點高通量測序的方法，通過 polysome profiling分離翻譯效率不同的mRNA轉錄本，逆轉錄構建測序文庫進行APA位點 高通量測序，分析測序數(shù)據(jù)來研究3'UTR長度與翻譯效率的關系。上述的方法都有其局限， 均不能同時對mRNA轉錄本和蛋白產(chǎn)量進行動態(tài)定量分析，而基因的表達調(diào)控是一個動態(tài)的 過程，涉及DNA的轉錄和mRNA的翻譯，僅通過最終蛋白的產(chǎn)量或者mRNA上核糖體結合數(shù)量不 能很好的反映3'UTR長度改變對翻譯效率影響的動態(tài)過程。近年來發(fā)展的RNA體內(nèi)熒光標記 技術，有望為動態(tài)研究3 ' UTR長度與翻譯效率關系提供更為直觀的新方法。
[0004] RNA體內(nèi)熒光標記技術是對傳統(tǒng)生物熒光標記技術的發(fā)展，傳統(tǒng)的生物熒光標記， 如綠色熒光蛋白（GFP)，可作為標準化的基因元件應用于對目標蛋白進行熒光標記，可檢測 基因的表達、目標蛋白的細胞定位等。2011年，來自美國康奈爾大學的研究人員在Science 上報道了一種名為Spinach的RNA熒光標記基因，其可在細胞中模仿GFP，將目的基因與 Spinach連接，轉錄出含有Spinach結構的融合RNA在熒光染料DFHBI下發(fā)出綠色熒光，從而 實現(xiàn)在細胞中對目的基因 mRNA轉錄本進行熒光標記。隨著不斷改進優(yōu)化，目前已開發(fā)出穩(wěn) 定性更高的RNA熒光標記基因 Spinach2和熒光染料DFHBI-1T。將熒光蛋白基因與RNA熒光標 記基因聯(lián)用構建雙熒光報告基因載體，連接上不同長度的3'UTR基因片段，可通過熒光同時 對mRNA轉錄本和蛋白產(chǎn)量進行動態(tài)測量，為研究3'UTR長度與翻譯效率關系帶來了新的思 路和策略。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有研究3'UTR與翻譯效率關系方法的局限，提供一種通 過雙熒光報告基因載體動態(tài)研究3'UTR對翻譯效率的作用的方法，同時本發(fā)明還提供了采 用所述方法研究3 ' UTR長度與翻譯效率的實例。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案分為以下兩個內(nèi)容：
[0007] (1)根據(jù)需要選擇合適的熒光蛋白載體，對載體進行適當?shù)母脑?，如在熒光蛋白?因末端插入終止密碼子;合成RNA熒光標記基因 tRNA-Spinach2或其他編碼可發(fā)熒光RNA分 子的DNA，并將其插入到上述改造的載體中，獲得雙熒光報告基因載體；
[0008] (2)將不同長度的3'UTR插入到雙熒光報告基因載體中，瞬時轉染細胞，在成像培 養(yǎng)基下進行熒光觀測，其中綠色熒光的強度代表轉錄本的量，紅色熒光強度代表熒光蛋白 的產(chǎn)量，在轉錄本量相同的情況下，蛋白產(chǎn)量越多，則表明翻譯效率越高，以此對熒光強度 數(shù)據(jù)進行標準化處理來判斷3 ' UTR長度與翻譯效率的關系。
[0009] 其中，所述步驟（1)的熒光蛋白載體可選用除綠色熒光蛋白以外的熒光蛋白載體， 因為Spinach2/DFHBI-1T復合物激發(fā)的是綠色熒光。
[0010] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明所述的雙熒光報告基因研究3'UTR長度與翻譯效率 關系的方法可通過測定熒光強度動態(tài)地對mRNA轉錄本和蛋白產(chǎn)量進行定量分析，適用于基 礎生物學研究，尤其適用于對3'UTR表達調(diào)控元件的研究。采用所述方法可以更為直觀地對 APA的功能進行研究，由此方法得到的結果可用于驗證polysome profi 1 ing結合APA位點高 通量測序的數(shù)據(jù)分析結果。
【附圖說明】
[0011 ]圖1為本發(fā)明所述實例中雙熒光報告基因載體pmCS2構建流程
[0012]圖2為本發(fā)明所述實例中雙熒光報告基因載體研究3'UTR與翻譯效率關系的原理 示意圖
[0013] 實施案例：
[0014] 為了更好地說明本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果，下面將以構建PmCS2雙熒光 報告載體的構建過程和具體的研究實例，結合附圖對本發(fā)明作進一步說明。
[0015] -、雙熒光報告基因載體pmCS2構建流程
[0016]構建過程中，所有合成引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；除了標明 出處的試劑，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。
[0017] T4DNA Ligase，T4PNK，去磷酸化酶，限制性核酸內(nèi)切酶Bbsl和Bgin是NEB公司的 產(chǎn)品；LA Taq polymerase，限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI和Sail購自Takara公司；焚光染料 DFHBI-Π '購自 Lucerna公司。
[0018] 雙熒光報告基因載體pmCS2的構建方法包括以下兩個步驟：
[0019] 步驟1.以載體pmCherry-Cl為基礎，截取Bbsl和Bgin兩個酶切位點的282bp基因 片段，設計PCR引物，在mCherry基因下游引物3 '末端加入終止密碼子TAG進行擴增，分別對 pmChrry-Cl和PCR產(chǎn)物用Bbsl和Bgl Π 進行雙酶切，將PCR產(chǎn)物連接到載體上，替換原來的 282bp基因片段，獲得改造的pmCherry-Cl載體，具體分為以下4步：
[0020] (1)對載體pmCherry-CIBbsI和Bgin酶切位點之間的282bp序列進行擴增，PCR引 物如下所示：
[0021 ] mCherry-Fl:5,-GAAGAAGACCATGGGCTGGGAG-3，
[0022] Bbsl
[0023] mCherry-Rl:5,~GATAGATCTCTACTTGTACAGCTCGTCCATGC~3'
[0024] Bgin terminator
[0025] 配制以下PCR反應體系：
[0026]
[0027] PCR循環(huán)的反應條件如下：
[0028]
[0029] 反應結束后，對PCR產(chǎn)物進行膠回收純化，回收295bp的片段。
[0030] (2)對載體pmCherry-Cl和步驟(1)中的PCR膠回收產(chǎn)物進行雙酶切，配制以下酶切 反應體系：
[0031]
[0032]
[0033] 混勻反應液，37°C水浴lh。反應結束后，膠回收純化雙酶切載體。
[0034] PCR產(chǎn)物雙酶切體系：
[0035]
[0036] 混勻反應液，37°C水浴20min。反應結束后，用膠回收試劑盒純化PCR雙酶切產(chǎn)物， 接著對純化產(chǎn)物進行磷酸化處理，配制以下反應體系：
[0037]
[0038] 混勻反應液，反應條件為:37°C30min，65°C20min。
[0039] (3)對步驟(2)的雙酶切產(chǎn)物進行連接，在連接反應體系中，載體與連接片段的個 數(shù)比例為1:5至1:6之間，配制以下混合反應液：
[0040]
[0041]
[0042]混勻反應液，16°C反應lh。反應結束后，將連接產(chǎn)物轉化至感受態(tài)DH5a中。
[0043] (4)挑取單菌落送至測序公司測序，測序引物用通用引物CMV-F，檢驗片段序列是 否插入終止密碼子TAG。檢驗無誤后可將經(jīng)改造的pmCherry-Cl載體轉染細胞觀察是否正常 表達紅色熒光蛋白。
[0044] 步驟2.向經(jīng)改造的pmCherry-Cl載體酶切位點EcoRI和Sail之間插入RNA熒光標記 基因 tRNA-Sp inach2，獲得雙熒光報告基因載體pmCS2，具體分為以下4步：
[0045] (1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成tRNA_Spinach2基因片段，在5'端加 入E c 〇 R I酶切位點，在3 '端加入S a 1 I酶切位點，序列如下所示：5 ' -GAATTCGCCCGGATAGCTCAGTCG