国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      致齲菌的定量檢測方法

      文檔序號:9722752閱讀:1893來源:國知局
      致齲菌的定量檢測方法
      【技術領域】
      [0001 ]本發(fā)明涉及臨床口腔醫(yī)學,具體涉及對致齲菌的定量檢測方法。
      【背景技術】
      [0002] 齲病是一種慢性感染性疾病,兒童是主要敏感人群之一。因其處于特殊年齡階段, 齲病的分布呈現(xiàn)不均衡狀態(tài),可累及多顆乳牙,引起廣泛齲損,進而影響口腔衛(wèi)生狀況和身 心健康。研究顯示,變形鏈球菌群(Streptococci mutants)中,以變形鏈球菌和遠緣鏈球菌 與齲病發(fā)生密切相關;乳桿菌在低齡兒童齲的發(fā)展中具有重要作用。近年來發(fā)現(xiàn),內(nèi)氏放線 菌與兒童齲病存在一定的相關性?,F(xiàn)有技術中運用實時熒光定量PCR檢測不同齲敏感兒童 唾液樣本中內(nèi)氏放線菌及齲齒放線菌的含量,發(fā)現(xiàn)唾液中內(nèi)氏放線菌的水平與兒童齲病的 相關性很高,而齲齒放線菌則無明顯相關性??谇痪呤且粋€復雜的微生物群落,齲病的發(fā) 生是多種細菌相互影響,造成口腔生態(tài)平衡失調(diào)的結果。所以,定量研究齲病始動因素菌斑 中主要致齲菌的比例,從細菌水平對兒童齲病狀況進行動態(tài)監(jiān)測,對其預防和治療具有重 要意義。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [0003] 本發(fā)明意在提供一種定量研究菌斑中主要致齲菌的比例的方法。
      [0004] 本發(fā)明中所提及的主要致齲菌是指變形鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌與內(nèi)氏 放線菌;
      [0005] 主要包括如下檢測方法:
      [0006] A.將無菌干燥濾紙lcmX lcm置于無菌潤濕液中潤濕,潤濕液由以下質(zhì)量百分數(shù)的 組分組成:蛋白胨0.1 %,表面活性劑0.1 %,氯化鈉0.85 %,余量為水;
      [0007] B.用無菌鑷子將潤濕后的濾紙取出并平鋪覆蓋在受測者牙頰面菌斑,停留30s采 樣即可;
      [0008] C.菌種計數(shù)
      [0009] 1)用無菌鑷子將上述采樣后的濾紙或者棉簽取下并置于10mL PH7.2的PBS緩沖液 中,漩渦振蕩混勻30s,使濾紙上的微生物充分釋放洗脫至緩沖液中,得處理液備用;
      [0010] 2)取少量處理液進行10倍稀釋,于TSA-0.6%YE平板上培養(yǎng)并計數(shù)再計算得到單 位檢測表面的微生物數(shù)量,計算公式如下:
      [0011] a = Log( 100N/m)+n+l
      [0012] 式中:a表示每100cm2面積接觸表面上致病菌對數(shù)值,單位為Log(CFU/100cm2);n 表示處理液10倍稀釋次數(shù);m表示取液量,單位為mL ;N表示η次10倍稀釋液取樣量m時對應的 平板菌落數(shù)CFU以及l(fā)cmX lcm總菌數(shù)。
      [0013] D.吸取lmL處理液,進行持續(xù)lmin的12000r/min的離心處理,棄上清,通過DNA試劑 盒提取樣本液中四種致齲菌的DNA;
      [0014] E.將四種致齲菌的DNA分別投入到對應的單試管PCR反應體系中,進行PCR擴增,紀 錄對應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對,計算出樣本的模板數(shù)量。
      [0015] F.計算四菌種的比例值及并推算lcmX lcm的各菌種數(shù)量。
      [0016] 采用本發(fā)明上具如下技術效果:
      [0017] 1、通過檢測四種致齲菌在牙斑中的比例,以及受試者實際齲齒情況的比對,進一 步完善當前齲齒風險評估的模型,使評估模型更為科學和準確化。
      [0018] 2、采用單試管PCT反應體系可以避免PCR污染
      【附圖說明】
      [0019] 圖1為按接觸表面微生物檢測方法,濾紙與棉簽比對的示意圖。
      [0020] 圖2為某一受測者的PCR定量檢測曲線。
      [0021 ]圖中2、3、4、5分別表示變形鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌與內(nèi)氏放線菌。
      【具體實施方式】
      [0022] 實施例一致齲菌的計數(shù)測量
      [0023] 采用本齲患風險評估模式對目標人群(共計150人,其中男性72,女性78人,平均年 齡36.2歲),口腔檢查與菌斑采集由2名口腔專業(yè)醫(yī)師擔任檢查者,現(xiàn)場采集相關數(shù)據(jù)。
      [0024] 將無菌干燥濾紙(1 cm X 1 cm)或者棉簽置于無菌潤濕液中潤濕,潤濕液由以下質(zhì)量 百分數(shù)的組分組成:蛋白胨0.1%,表面活性劑0.1%,氯化鈉0.85%,余量為水;
      [0025] 用無菌鑷子將潤濕后的濾紙取出并平鋪覆蓋在受測者牙頰面菌斑,停留30s采樣 即可?;蛘呙藓灩稳⊙李a面菌斑表面。
      [0026] 接觸表面微生物檢測方法,步驟如下:
      [0027] 1)用無菌鑷子將上述采樣后的濾紙或者棉簽取下并置于10mL pH7.2的PBS緩沖液 中,漩渦振蕩混勻30s,使濾紙上的微生物充分釋放洗脫至緩沖液中,得處理液備用;
      [0028] 2)取少量處理液進行10倍稀釋,于TSA_0.6%YE平板上培養(yǎng)并計數(shù)(即稀釋平板計 數(shù)法),再計算得到單位檢測表面的微生物數(shù)量,計算公式如下:
      [0029] a = Log( 100N/m)+n+l
      [0030] 式中:a表示每100cm2面積接觸表面上致病菌對數(shù)值,單位為Log(CFU/100cm2) ;n表 示處理液10倍稀釋次數(shù);m表示取液量,單位為mL;N表示η次10倍稀釋液取樣量m時對應的平 板菌落數(shù)CFU。記下總菌數(shù)。
      [0031 ]吸取 lmL 上述處理液,12000r/min離心 lmin,棄上清,按照TIANampBacteriaDNAKit 試劑盒操作步驟在室溫下提取DNA,GeneQuantpro紫外/可見光分光光度儀檢測DNA濃度和 純度。
      [0032] 如圖1所示,在采用接觸表面微生物檢測方法的前提下,使用已知菌種數(shù)來比對濾 紙與棉簽兩種采樣方式,濾紙采樣更接近真實值。
      [0033] 實施例二
      [0034] 為每個菌種設計PCR反應體系,每個PCR反應管中內(nèi)設有與相應菌種對應的探針。
      [0035]
      [0036]先合成與檢測菌種的基因型對應的模板序列,將引物與模板序列連接,然后使用 帶有地高辛標記的RNAntpmix對合成的序列進行標記,從而作完成探針。
      [0037] 將按照TIANampBacteriaDNAKit試劑盒提取的四種致齲菌的DNA分別投入到對應 的PCR反應體系中,每個菌種的反應體系均建立在單個PCR反應管中;進行PCR擴增,紀錄對 應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對,計算出樣本的模板數(shù)量。同時記錄此次 四種菌種的比例值,與實施例一中求得的總菌數(shù)結合,推算出相應菌種數(shù)量,更有利于準確 牙斑表面的菌群狀況。
      [0038]采用SPSS17.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行X2檢驗、配對t檢驗,P<0.05為差異具有顯 著性。
      [0039] 實施例三結合致齲菌的比例,繪制相應的齲齒風險評估表(LogC均以10為底數(shù))
      [0040] 表1風險評估表
      [0041]

      [0043] 近期評價結果:
      [0044] 采用本齲患風險評估模式對目標人群(共計150人,其中男性72,女性78人,平均年 齡36.2歲)進行齲患風險評估,評估為中低危人數(shù)101人,高危人數(shù)為49人,縱向研究分別在 6個月,12個月后進行回訪復查,評估目標人群在6個月,12個月實際新增齲情況,評估本齲 患風險評估表的有效性。結果如下:
      [0045]
      [0046]
      [0047]以上所述的僅是本發(fā)明的實施例,方案中公知的具體結構及特性等常識在此未作 過多描述。應當指出,對于本領域的技術人員來說,在不脫離本發(fā)明結構的前提下,還可以 作出若干變形和改進,這些也應該視為本發(fā)明的保護范圍,這些都不會影響本發(fā)明實施的 效果和專利的實用性。本申請要求的保護范圍應當以其權利要求的內(nèi)容為準,說明書中的 【具體實施方式】等記載可以用于解釋權利要求的內(nèi)容。
      【主權項】
      1.致齲菌的定量檢測方法,齲菌是指變形鏈球菌、遠緣鏈球菌、嗜酸乳桿菌與內(nèi)氏放線 菌;其特征在于: 包括如下檢測步驟: A. 將無菌干燥濾紙lcmXlcm置于無菌潤濕液中潤濕,潤濕液由以下質(zhì)量百分數(shù)的組分 組成:蛋白胨0.1 %,表面活性劑0.1 %,氯化鈉0.85 %,余量為水; B. 用無菌鑷子將潤濕后的濾紙取出并平鋪覆蓋在受測者牙頰面菌斑,停留30s采樣即 可; C. 菌種計數(shù) 1) 用無菌鑷子將上述采樣后的濾紙或者棉簽取下并置于10mLPH7.2的PBS緩沖液 中,漩渦振蕩混勻30s,使濾紙上的微生物充分釋放洗脫至緩沖液中,得處理液備用; 2) 取少量處理液進行10倍稀釋,于TSA-0.6%YE平板上培養(yǎng)并計數(shù)再計算得到單位 檢測表面的微生物數(shù)量,計算公式如下: a=Log(100N/m)+n+l 式中:a表示每100cm2面積接觸表面上致病菌對數(shù)值,單位為L〇g(CFU/100cm2) ;n表 示處理液10倍稀釋次數(shù);m表示取液量,單位為mL;N表示η次10倍稀釋液取樣量m時 對應的平板菌落數(shù)CFU以及1cmX1cm總菌數(shù); D. 吸取1mL處理液,進行持續(xù)1min的12000r/min的離心處理,棄上清,通過DNA試劑 盒提取樣本液中四種致齲菌的DNA; E. 將四種致齲菌的DNA分別投入到對應的單試管PCR反應體系中,進行PCR擴增,紀錄對 應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對,計算出樣本的模板數(shù)量; F. 計算四菌種的比例值及并推算1cmX1cm的各菌種數(shù)量。
      【專利摘要】本發(fā)明涉及臨床口腔醫(yī)學,具體涉及對致齲菌的定量檢測方法。致齲菌的定量檢測方法,包括如下檢測步驟:A.采樣并制取處理液;C.菌種計數(shù);D.吸取1mL處理液,進行持續(xù)1min的12000r/min的離心處理,棄上清,通過DNA試劑盒提取樣本液中四種致齲菌的DNA;E.將四種致齲菌的DNA分別投入到對應的單試管PCR反應體系中,進行PCR擴增,紀錄對應的擴增曲線;將所得的擴增曲線與標準曲線比對,計算出樣本的模板數(shù)量;F.計算四菌種的比例值及并推算1cm×1cm的各菌種數(shù)量。本發(fā)明通過檢測四種致齲菌在牙斑中的比例,以及受試者實際齲齒情況的比對,進一步完善當前齲齒風險評估的模型,使評估模型更為科學和準確化。
      【IPC分類】C12Q1/06, C12R1/46, C12Q1/68, C12R1/23, C12Q1/14
      【公開號】CN105483215
      【申請?zhí)枴緾N201510834186
      【發(fā)明人】楊德琴, 羅凌飛, 竇磊, 劉鑫, 徐智云, 黃興, 薛慧, 高敬
      【申請人】重慶醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院
      【公開日】2016年4月13日
      【申請日】2015年11月25日
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1