一種食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生化鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快 速鑒定方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 食品安全是關(guān)系到人類健康和國(guó)計(jì)民生的重大問(wèn)題，而微生物安全是食品安全的 重中之重。由于食品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，微生物污染食品后快速繁殖數(shù)量呈幾何級(jí)增 長(zhǎng)，從而造成嚴(yán)重的食品安全問(wèn)題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)2012年發(fā)生食物中毒事件6685起，其中微 生物性食物中毒事件中毒人數(shù)最多，占總數(shù)的56.1% ; 1988-2008年，美國(guó)電子食源性暴發(fā) 報(bào)告系統(tǒng)(eFORS)共報(bào)道了 13405起食源性疾病暴發(fā)事件，其中3613食源性暴發(fā)事件有細(xì)菌 引起，占已知病原暴發(fā)事件的45%。腸桿菌科細(xì)菌分布廣，現(xiàn)有的分類方法將其劃分為42屬 與8個(gè)未分類的群，包括沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和致病性大腸埃希菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌等 與食源性疾病暴發(fā)相關(guān)的重要致病菌。因此對(duì)腸桿科菌的篩選和鑒定是檢驗(yàn)檢疫微生物實(shí) 驗(yàn)室的一項(xiàng)主要任務(wù)。本研究團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期從事食品微生物安全領(lǐng)域的研究和開(kāi)發(fā)工作，開(kāi)發(fā) 出了系列快速檢測(cè)技術(shù)，在食源性致病菌菌種資源上目前共保藏菌種20000株，其中腸桿科 菌超過(guò)10000株，為各類細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)的研究提供了資源基礎(chǔ)。
[0003] 細(xì)菌篩選與鑒定應(yīng)用最廣泛最基礎(chǔ)的方法是生化鑒定方法。細(xì)菌數(shù)值鑒定是在生 化鑒定方法的基礎(chǔ)上結(jié)合數(shù)碼鑒定原理發(fā)展而來(lái)的生化鑒定法，這種方法具有傳統(tǒng)生化鑒 定法的直觀、可靠等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合了數(shù)碼鑒定原理，使鑒定結(jié)果更具科學(xué)性和可重復(fù)性。
[0004] 腸桿科菌為革蘭氏陰性桿狀，發(fā)酵型、周生和氧化酶陰性的細(xì)菌。它在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué) 和遺傳學(xué)研究上都具有特殊的重要性。因此，人們都予以極大的重視。雖然腸桿科菌與鄰近 菌科的界線較為明確，但屬間沒(méi)有清晰的界線，因此，它們彼此不易鑒別。目前腸桿科菌的 生化鑒定主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)基選擇法、微量生化管鑒定法以及數(shù)值生化鑒定法。前兩種方 法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，數(shù)值鑒定法以其快速、鑒定率高、便于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、商品化、標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn) 已成為食品衛(wèi)生和臨床等領(lǐng)域細(xì)菌鑒定的主導(dǎo)方法，使其在世界范圍得到了廣泛的認(rèn)可和 快速的發(fā)展。
[0005] 目前商品化的腸桿科數(shù)值鑒定系統(tǒng)有被譽(yù)為"全球金標(biāo)準(zhǔn)"的法國(guó)梅里埃公司的 API20E，是被開(kāi)發(fā)的第一個(gè)鑒定系統(tǒng)，無(wú)需專用儀器，標(biāo)準(zhǔn)化手工方法完成細(xì)菌的生化鑒 定，為低成本替代傳統(tǒng)手工細(xì)菌生化鑒定的最佳產(chǎn)品。API 20E腸道菌鑒定試劑條24小時(shí)內(nèi) 鑒定革蘭氏陰性桿菌，覆蓋臨床常見(jiàn)的細(xì)菌，包括70個(gè)腸桿科菌種與32個(gè)其它腸道菌種，比 如氧化酶陽(yáng)性發(fā)酵菌-3個(gè)氣單胞菌屬、6個(gè)弧菌屬、3個(gè)巴斯德菌屬、非發(fā)酵菌-1個(gè)不動(dòng)桿菌 屬、4個(gè)假單胞菌屬等。而腸桿科菌根據(jù)伯杰氏手冊(cè)大約有上述數(shù)值的2倍之多。因此API20E 所涵蓋的分類單元數(shù)量相對(duì)較少。另一款較為大眾接受的數(shù)值鑒定系統(tǒng)則是英國(guó)Microgen 公司的MID-GNA或/和MID-GNB，MID-GNA可以單獨(dú)使用，能夠鑒定41個(gè)腸桿科菌種和3個(gè)非發(fā) 酵菌不動(dòng)桿菌屬;MID-GNA和MID-GNB的配合使用能夠鑒定134個(gè)腸桿科菌和41個(gè)其它革蘭 氏陰性菌，比如非發(fā)酵菌-1個(gè)不動(dòng)桿菌屬、7個(gè)假單胞菌屬、氧化酶陽(yáng)性發(fā)酵菌-11個(gè)弧菌 屬、4個(gè)氣單胞菌屬、2個(gè)巴斯德菌屬等。Microgen公司的產(chǎn)品雖然所涵蓋的分類單元數(shù)量較 API20E多，但就準(zhǔn)確度說(shuō)，使用者更傾向于API20E。生化鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)是整個(gè)系統(tǒng)的心 臟，基礎(chǔ)數(shù)據(jù)即陽(yáng)性概率應(yīng)用不當(dāng)，能使鑒定結(jié)果錯(cuò)誤率升高。我們發(fā)現(xiàn)，數(shù)據(jù)庫(kù)中 Citrobacter amalonaticus(無(wú)丙二酸鹽梓檬酸桿菌)在尿酶上API與MID系統(tǒng)存在一定的 差異，API尿酶的陽(yáng)性出現(xiàn)概率為1 %，MID則為85%，出現(xiàn)這種情況的原因主要是生化實(shí)驗(yàn) 出現(xiàn)的陽(yáng)性概率與檢驗(yàn)方法密切相關(guān)，如尿素、硫化氫等，不同方法出現(xiàn)的頻率是不同的， 因此造成鑒定結(jié)果不一致。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中數(shù)值鑒定方法存在的缺點(diǎn)，提供一種更全面、更 準(zhǔn)確的食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法。
[0007] 本發(fā)明的食源性致病菌腸桿科菌種的數(shù)值快速鑒定方法，其特征在于，包括以下 步驟：
[0008] a、確定腸桿科菌的種類及其至少24個(gè)生化實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性的概率，所述的24個(gè)生化 實(shí)驗(yàn)為:苯丙氨酸脫氨、木糖、棉子糖、吲哚、蔗糖、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、乳糖、0NPG、尿酶、檸檬酸 鹽、麥芽糖、賴氨酸脫羧酶、丙二酸鹽、山梨醇、衛(wèi)矛醇、阿拉伯糖、蜜二糖、鼠李糖、七葉苷、 Mr、H2S、海藻糖、纖維二糖、氧化酶;這些生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率可以根據(jù)伯杰氏手冊(cè)等權(quán)威 資料，獲得每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性的概率；
[0009] b、選擇步驟a中的24個(gè)生化實(shí)驗(yàn)作為數(shù)值法中所需要的生化反應(yīng)：
[0010] c、建立腸桿科菌的數(shù)據(jù)庫(kù)，確定數(shù)值法中計(jì)算方法:根據(jù)選擇的分類單元與生化 實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率，形成一個(gè)概率矩陣；
[0011] 按照細(xì)菌概率鑒定理論確定每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒 定百分?jǐn)?shù)的計(jì)算方法，具體計(jì)算公式如下：
[0012] 每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率等于該分類單元對(duì)應(yīng)的每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率 的乘積；
[0013] 多項(xiàng)總發(fā)生頻率等于每一個(gè)分類單元的總出現(xiàn)頻率的總和；
[0014] 鑒定百分?jǐn)?shù)等于每一個(gè)分類單元總出現(xiàn)頻率除以多項(xiàng)總發(fā)生頻率再乘以100,全 體鑒定百分?jǐn)?shù)之和應(yīng)等于1〇〇;
[0015] d、待測(cè)菌株純培養(yǎng)后，進(jìn)行革蘭氏染色，氧化酶，0F試驗(yàn)，選擇革蘭氏染色為陰性、 氧化酶陰性，0F為發(fā)酵型的菌株進(jìn)行步驟a的24種生化實(shí)驗(yàn)，可以使用商品化的鑒定條，也 可以購(gòu)買(mǎi)生化管或自行配制培養(yǎng)基進(jìn)行生化實(shí)驗(yàn)；
[0016] e、獲得待測(cè)菌株的24種生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，根據(jù)生化反應(yīng)的陰、陽(yáng)、未知值，按照計(jì) 算方法對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有分類單元進(jìn)行計(jì)算，首先將生化實(shí)驗(yàn)值轉(zhuǎn)換成概率值，即實(shí)驗(yàn)結(jié)果 為陽(yáng)性則就是對(duì)應(yīng)生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值;若為陰性則100減去生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率值，上 述結(jié)果若是〇或1〇〇,則用近似值1或99代替，再按照步驟c的計(jì)算方法計(jì)算每一個(gè)分類單元 的總出現(xiàn)頻率、多項(xiàng)總發(fā)生頻率、鑒定百分?jǐn)?shù)、若某項(xiàng)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果為未知或模糊不清，則 該生化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)不參與計(jì)算，從而不影響最終的鑒定結(jié)果；
[0017] f·、根據(jù)計(jì)算結(jié)果，對(duì)待測(cè)菌株鑒定結(jié)果進(jìn)行判定:根據(jù)鑒定百分?jǐn)?shù)的大小進(jìn)行排 序，鑒定百分?jǐn)?shù)最高相對(duì)應(yīng)的菌株即為待測(cè)菌株所屬的分類單元。評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的制定是在現(xiàn) 有商品化國(guó)際上公認(rèn)的兩種鑒定系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，結(jié)合中國(guó)食源性腸桿科菌種主要生化型、 血清型、基因型方面進(jìn)行的，具有中國(guó)特色性，比公認(rèn)的兩種鑒定系統(tǒng)更適用于國(guó)內(nèi)腸桿菌 科菌的鑒定結(jié)果評(píng)價(jià)。
[0018] 優(yōu)選，對(duì)待測(cè)菌株的鑒定都給出不一致的生化實(shí)驗(yàn)并單列出來(lái)。
[0019] 優(yōu)選，在結(jié)果顯示中，對(duì)分類單元給出中文，拉丁文對(duì)照，符合中國(guó)人的書(shū)寫(xiě)習(xí)慣。
[0020] 本發(fā)明的確定腸桿菌科31個(gè)屬139個(gè)種，總計(jì)159個(gè)分類單元及其47種(包含上述 24種生化實(shí)驗(yàn))生化實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性概率，該159個(gè)分類單元分別如下：1-Escherichia spp(埃 希氏菌屬），2-Escherichia coli (大腸埃希氏菌），3-Escherichia col，inactive(大腸埃 希氏菌，不活潑），4_Escherichia blattae(幢螂埃希氏菌），5_Escherichia fergusanii (弗格森埃希氏菌），6_Escherichia hermannii(赫氏埃希氏菌），7_Escherichia vulneris (傷口埃希氏菌），8_Budvicia aquatia(水生布特維西菌），9_Buttiauxella spp(布丘桿菌 屬），l〇-Buttiauxella agrestis(鄉(xiāng)間布丘桿菌），11-Buttiauxel la brennerae , 12-Buttiauxella ferragutiae，13-Buttiauxella gaviniae,14-Buttiauxella izardii,15-Butt iauxel la noackiae (諾氏布丘桿菌），16-Butt iauxel la warmboldiae，17-cedecea spp(西地西菌屬），18-cedecea davisae(戴氏西地西菌），19-cedecea lapagei (拉氏西地 西菌），20_cedecea neteri(奈氏西地西菌），21_cedecea species 3(西地西菌3號(hào)），22_ 06(16063 8卩6(^68 5(西地西菌5號(hào)），23-〇；^1'(^&(^6『8卩卩（梓檬酸桿菌屬），24-Citrobacter amalonaticus(無(wú)丙二酸鹽梓檬酸桿菌），25-Citrobacter freundii(弗氏梓 檬酸桿菌），26_Citrobacter braakii (布氏梓檬酸桿菌），27_Citrobacter farmeri (法氏 梓檬酸桿菌），28_Citrobacter gillenii，29_Citrobacter koseri(C.diversus)(差異梓 檬酸桿菌），30_Citrobacter murliniae，31-Citrobacter rodentium(腐蝕梓檬酸桿菌）， 32-Citrobacter sedlakii(塞氏梓檬酸桿菌），33-Citrobacter werkmanii(魏氏梓檬酸桿 菌），34_Citrobacter youngae(楊氏梓檬酸桿菌）），35_Edwardsiella spp(愛(ài)德華氏菌 屬），36_Edwardsiella tarda(遲純愛(ài)德華氏菌