一種樹枝大分子—共聚物細(xì)胞捕獲材料及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于生物大分子分離分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及為一種樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料及其制備方法和應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]近年來(lái)對(duì)于腫瘤細(xì)胞分離的研究受到了極大地關(guān)注。研究表明，不同種類的腫瘤細(xì)胞可以被用作預(yù)測(cè)標(biāo)志物，而對(duì)它們的檢測(cè)可以反映出實(shí)體腫瘤的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和進(jìn)展，有利于腫瘤的及時(shí)發(fā)現(xiàn)、及早診斷和有效治療，因此發(fā)展出高效率、高靈敏度的方法分離腫瘤細(xì)胞就成為關(guān)鍵步驟，為其后續(xù)檢測(cè)提供了無(wú)限可能。
[0003]隨著人們對(duì)腫瘤細(xì)胞分離研究的不斷深入，涌現(xiàn)出了種類繁多的新技術(shù)用于捕獲和檢測(cè)腫瘤細(xì)胞。根據(jù)分離機(jī)理的不同，這些新技術(shù)新方法可以分為物理分離和生物親和分離:物理分離法富集腫瘤細(xì)胞主要利用的是腫瘤細(xì)胞的尺寸、密度和變形性不同于正常血細(xì)胞，這種方法簡(jiǎn)單便捷，但是特異性和靈敏度均較差，限制了其實(shí)際應(yīng)用；生物親和分離法富集腫瘤細(xì)胞則是通過(guò)引入抗體、適配體等可與細(xì)胞膜表面特異性作用的生物分子來(lái)實(shí)現(xiàn)，此方法效率高、特異性強(qiáng)、對(duì)細(xì)胞損傷小，更具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。一般生物親和法以微流控芯片或者功能化材料為基底，微流控芯片分離效率高但耗時(shí)長(zhǎng)、細(xì)胞損傷大;功能化材料有免疫磁珠、納米陣列材料、仿生材料等，可高效快速捕獲腫瘤細(xì)胞，是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。
[0004]為達(dá)到高效分離腫瘤細(xì)胞和保持細(xì)胞活性的目的，本發(fā)明設(shè)計(jì)并制備了一種氨基苯硼酸修飾的樹枝狀大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料，降低了材料的非特異性吸附和毒性，提高了材料的親水性和修飾性，同時(shí)膠體材料和液體易于分離，無(wú)需離心操作，可高效捕獲細(xì)胞，捕獲后的細(xì)胞活性無(wú)明顯損傷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種材料的非特異性吸附和毒性低，親水性和修飾性好的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料及其制備方法和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料，所述共聚物為丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯共聚物，樹枝狀大分子通過(guò)碳二亞胺交聯(lián)法修飾于共聚物表面，再通過(guò)戊二醛交聯(lián)法將3-氨基苯硼酸和樹枝狀大分子偶聯(lián)得到。其中，作為基底的丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯共聚物具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。本發(fā)明材料通過(guò)共聚物的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)增加了材料和細(xì)胞的接觸幾率，有利于提高捕獲效率;樹枝狀分子含128個(gè)伯氨基，可大大增強(qiáng)苯硼酸得修飾量，為高效捕獲奠定基礎(chǔ)，同時(shí)樹枝大分子也是親水分子，保持了材料的超親水性;苯硼酸用于和腫瘤細(xì)胞膜表面過(guò)表達(dá)的唾液酸結(jié)合，將目標(biāo)細(xì)胞成功分離;材料的超親水性和共聚物的低毒性使得捕獲后的細(xì)胞活性高度保持。
[0007]本發(fā)明提出的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料的制備方法，具體步驟如下:
(I)共聚物基底的合成:將丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，PEG-6000按照質(zhì)量比為1: 1: 1.5至I: 1:2的比例溶于PBS溶液中；向96孔板每孔加入述溶液50 yL，以及甲基丙烯酸甲酯0.5-5.0 yL，四甲基乙二胺0.4-1.0 yL，10%過(guò)硫酸銨溶液2.0-5.0 yL,30-60 °C溫度下震蕩反應(yīng)0.5-2.0 h，得到乳白色膠狀固體，用PBS溶液洗凈；
(2)樹枝狀大分子的修飾:將由步驟(I)制備的共聚物基底材料用紫外線照射10-20min，再用PBS清洗，向材料中加入質(zhì)量比為1:1至1:2的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的PBS溶液，活化0.5-1.0 h;然后加入0.5-10.0μL的PAMAM樹枝狀大分子(乙二胺核)，30-37°C反應(yīng)2-6 h，用PBS洗凈；
(3)3-氨基苯硼酸的修飾:采用戊二醛交聯(lián)法將氨基苯硼酸修飾在樹枝狀分子上，先用5%戊二醛的I3BS溶液，活化修飾了樹枝大分子的共聚物基底2-3 h，用I3BS清洗后，加入濃度為2.0 mg/mL-20.0 mg/mL的氨基苯硼酸溶液，30_37°C偶聯(lián)3-6 h，然后用含1%氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用I3BS洗凈，即得到苯硼酸修飾的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料。
[0008]本發(fā)明制備的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料可用于可高效捕獲細(xì)胞(人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251)，捕獲后的細(xì)胞活性無(wú)明顯損傷。
[0009]細(xì)胞捕獲的操作步驟為:向含氨基苯硼酸修飾的樹枝大分子一共聚物材料的96孔板中加入100 yL人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251懸浮液，細(xì)胞密度為105-106，在培養(yǎng)箱(37°C，5%CO2)孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計(jì)算細(xì)胞的捕獲效率。向捕獲后的細(xì)胞加入10 yg/mL的DAPI染料，室溫染色15 min后洗凈，用熒光顯微鏡觀察。為驗(yàn)證材料的高效性，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分別用未經(jīng)修飾的共聚物材料、未經(jīng)樹枝大分子偶聯(lián)直接修飾氨基苯硼酸的共聚物材料和經(jīng)樹枝大分子偶聯(lián)的氨基苯硼酸修飾的共聚物材料進(jìn)行細(xì)胞捕獲實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明樹枝大分子偶聯(lián)的氨基苯硼酸共聚物材料具有最優(yōu)的捕獲效率，可高達(dá)87±5%。
[0010]細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn):向捕獲細(xì)胞后的材料按I: I投料比加入吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)染料，室溫染色15 min后洗凈，顯微鏡觀察，活細(xì)胞呈現(xiàn)黃綠色，死細(xì)胞為紅色，結(jié)果表明捕獲后的細(xì)胞活性接近100%。
[0011]通過(guò)上述步驟成功實(shí)現(xiàn)了樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料的制備及應(yīng)用，材料的進(jìn)一步表征通過(guò)掃描電子顯微鏡(SEM)、元素分析(EDS)、紫外吸收光譜(UV)和熒光圖像說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料的制備及應(yīng)用流程圖。
[0013]圖2材料捕獲細(xì)胞前后的SEM圖像。
[0014]圖3氨基苯硼酸修飾的樹枝大分子一共聚物材料的元素分析。
[0015]圖4樹枝大分子偶聯(lián)前后吸光度對(duì)比圖。
[0016]圖5經(jīng)樹枝大分子偶聯(lián)的氨基苯硼酸修飾的共聚物材料、未經(jīng)樹枝大分子偶聯(lián)直接修飾氨基苯硼酸的共聚物材料和未經(jīng)修飾的共聚物材料捕獲效率熒光對(duì)比圖。
[0017]圖6細(xì)胞活性熒光圖像。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1:氨基苯硼酸為“誘館”的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超親水樹枝分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料的合成
將丙烯酰胺，甲叉丙烯酰胺，PEG-6000按照質(zhì)量比為I:1:1.5溶于PBS溶液中，向96孔板每孔加入述溶液50 yL，甲基丙烯酸甲酯0.5-5.0 yL，四甲基乙二胺0.6 yL，10%過(guò)硫酸銨溶液2.5 yL，50 °C，震蕩反應(yīng)I h，得到乳白色膠狀固體，用PBS溶液洗凈。共聚物基底材料經(jīng)紫外線照射10 min，再用PBS清洗，向材料中加入質(zhì)量比為1:1的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)的I3BS溶液，活化0.5 h后，加入0.5-10.0yL的PAMAM樹枝狀大分子(乙二胺核)，37°C反應(yīng)2-6 h，用I3BS洗凈。采用戊二醛交聯(lián)法將氨基苯硼酸修飾在樹枝狀分子上，先用5%戊二醛的PBS溶液，活化修飾了樹枝大分子的共聚物基底2-3 h，用PBS清洗后，加入濃度為2.0 mg/mL-20.0 mg/mL的氨基苯硼酸溶液，37°C偶聯(lián)4 h后，用含1%氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端I h，最后用PBS洗凈，得到氨基苯硼酸為“誘館”的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超親水樹枝分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料。
[0019]實(shí)施例2:三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的超親水樹枝分子一共聚物材料在捕獲人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中的應(yīng)用
向含氨基苯硼酸修飾的樹枝大分子一共聚物材料的96孔板中加入100 yL人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251懸浮液，細(xì)胞密度為105-106，在培養(yǎng)箱(37°C，5% CO2)孵育5_90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計(jì)算細(xì)胞的捕獲效率。向捕獲后的細(xì)胞加入10 yg/mL的DAPI染料，室溫染色15 min后洗凈，用熒光顯微鏡觀察。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料，其特征在于:所述共聚物為丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯共聚物，樹枝狀大分子通過(guò)碳二亞胺交聯(lián)法修飾于共聚物表面，再通過(guò)戊二醛交聯(lián)法將3-氨基苯硼酸和樹枝狀大分子偶聯(lián)得到。2.如權(quán)利要求1所述的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料的制備方法，其特征在于，具體步驟為: (1)共聚物基底的合成:將丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、PEG-6000按照質(zhì)量比為1:1:(1.5-2)的比例溶于PBS溶液中；向96孔板每孔加入述溶液50 yL，以及甲基丙烯酸甲酯0.5-5.0 μL，四甲基乙二胺0.4-1.0 yL，10%過(guò)硫酸銨溶液2.0-5.0 yL，在30-60 °(3溫度下震蕩反應(yīng)0.5-2.0 h，得到乳白色膠狀固體，用PBS溶液洗凈； (2)樹枝狀大分子的修飾:將由步驟(I)制備的共聚物基底材料用紫外線照射10-20min，再用PBS清洗，向材料中加入質(zhì)量比為1:(1-2)的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺的PBS溶液，活化0.5-1.0 h;然后加入0.5-10.0yL的PAMAM樹枝狀大分子，30-37°C反應(yīng)2-6 h，用PBS洗凈； (3)3-氨基苯硼酸的修飾:采用戊二醛交聯(lián)法將氨基苯硼酸修飾在樹枝狀分子上，先用5%戊二醛的I3BS溶液，活化修飾了樹枝大分子的共聚物基底2-3 h，用I3BS清洗后，加入濃度為2.0 mg/mL-20.0 mg/mL的氨基苯硼酸溶液，30_37°C偶聯(lián)3-6 h，然后用含1%氰基硼氫化鈉的PBS溶液封端0.5-2 h，最后用I3BS洗凈，即得到苯硼酸修飾的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料。3.如權(quán)利要求1所述的樹枝大分子一共聚物細(xì)胞捕獲材料在捕獲人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中的應(yīng)用。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于細(xì)胞捕獲的操作步驟為:向含氨基苯硼酸修飾的樹枝大分子一共聚物材料的96孔板中加入100 yL人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251懸浮液，細(xì)胞密度為105-106，在培養(yǎng)箱孵育5-90 min后，吸取上清液并用PBS浸洗3次，計(jì)算細(xì)胞的捕獲效率；向捕獲后的細(xì)胞加入10 yg/mL的DAPI染料，室溫染色15 min后洗凈，用熒光顯微鏡觀察。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物大分子分離分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種樹枝大分子—共聚物細(xì)胞捕獲材料及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明首先合成丙烯酰胺和甲基丙烯酸甲酯的共聚物基底，再為基底修飾上聚酰胺-胺型樹枝狀高分子，最后利用樹枝狀分子偶聯(lián)苯硼酸，從而得到可用于細(xì)胞捕獲的功能化材料。實(shí)驗(yàn)表明，由于共聚物基底的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和樹枝狀分子可增加苯硼酸修飾量，這種功能化材料可以在45分鐘內(nèi)捕獲87±5%的細(xì)胞；并且由于共聚物基底和樹枝狀分子均為超親水化合物，捕獲的細(xì)胞保持高度活性。本發(fā)明利用無(wú)模板，低成本，低毒性材料，將其應(yīng)用于細(xì)胞捕獲，新穎便捷，實(shí)用高效，穩(wěn)定性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12N5/09, C08G81/02
【公開號(hào)】CN105504301
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510882965
【發(fā)明人】高明霞, 張祥民, 張珮明
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2015年12月7日