一種數(shù)字等溫核酸檢測裝置及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物醫(yī)學(xué)核酸檢測裝置，特別涉及一種用于核酸數(shù)字等溫?cái)U(kuò)增的 微流控裝置及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)研究正從整體和細(xì)胞水平深入到分子水平。核酸是細(xì)胞內(nèi)一類重要 的生物分子，參與調(diào)控細(xì)胞的大部分功能，如基因的表達(dá)和沉默、細(xì)胞器組成以及細(xì)胞行為 調(diào)控等。了解核酸在不同細(xì)胞的含量與分布對深入研究其功能及其背后生物學(xué)意義至關(guān)重 要，對惡性腫瘤、艾滋病、遺傳性疾病的診斷和治療具有重要意義。
[0003] 現(xiàn)有的核酸檢測主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)，PCR方法靈敏度高、特異性 好，是目前最常用的基因診斷方法。然而PCR方法操作起來較復(fù)雜，對儀器和人員要求比較 高，不適合基層或現(xiàn)場快速診斷。而且有些樣品稀少無法在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，樣品量不足以進(jìn)行 傳統(tǒng)的PCR核酸分析，例如腫瘤循環(huán)細(xì)胞、組織微陣列、早期發(fā)育的胚胎細(xì)胞等，這些都是核 酸分析遇到的難題。
[0004] 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Isothermal Amplification Technology)是核酸體外擴(kuò)增技術(shù)， 其反應(yīng)過程始終維持在恒定的溫度下，通過添加不同活性的酶和各自特異性引物來達(dá)到快 速核酸擴(kuò)增的目的。常見的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP、滾環(huán)擴(kuò)增技 術(shù)RCA、單引物等溫?cái)U(kuò)增SPIA、依賴解旋酶的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)HAD、鏈替代擴(kuò)增SDA、交叉引物擴(kuò) 增技術(shù)CPA等。等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有操作簡便、反應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合快速診斷領(lǐng) 域。但現(xiàn)有的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)樣品的準(zhǔn)確和絕對定量，限制了其應(yīng)用。
[0005] 數(shù)字PCR(Digital PCR)技術(shù)是20世紀(jì)末由Vogelstein等人提出的一種高靈敏度 核酸檢測和定量方法。數(shù)字PCR通過將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每 個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板），實(shí)現(xiàn)"單分子模板PCR擴(kuò) 增"，擴(kuò)增結(jié)束后，通過呈現(xiàn)陽性陰性信號類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可以 實(shí)現(xiàn)真正意義上的絕對定量分析?，F(xiàn)有的數(shù)字PCR技術(shù)多采用流式檢測技術(shù)，對儀器要求較 高，且檢測時(shí)間長，無法滿足核酸現(xiàn)場快速檢測需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述技術(shù)中存在的不足之處，本發(fā)明提供一種便攜式、快速、靈敏、可絕對定 量的數(shù)字等溫核酸擴(kuò)增裝置。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] -種數(shù)字等溫核酸檢測裝置，其包括，
[0009] 微流控芯片，其通過呈片層結(jié)構(gòu)的基板層、設(shè)于所述基板層上的通道層及設(shè)于所 述通道層上方的蓋片層依次層合形成用于微滴生成的微流控通道和用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng) 區(qū)間；
[0010] 溫控系統(tǒng)，其包括自下向上對所述基板層施加壓力的下壓板及自上向下對所述蓋 片層施加壓力的上壓板，所述上壓板及所述下壓板內(nèi)均設(shè)有溫度傳感芯片及用于對反應(yīng)區(qū) 間進(jìn)行加熱的溫控加熱元件，所述溫控加熱元件為加熱片，所述溫度傳感芯片及所述溫控 加熱元件均貼合于施壓面設(shè)置；
[0011]壓力驅(qū)動系統(tǒng)，其連接于所述微流控芯片，用于向微流控芯片內(nèi)通道層施加壓力， 以使待測液自流入端流入反應(yīng)區(qū)間內(nèi)。
[0012] 優(yōu)選的是，其中，所述壓力驅(qū)動系統(tǒng)為真空負(fù)壓系統(tǒng)或由注射栗驅(qū)動的正壓系統(tǒng)。
[0013] 優(yōu)選的是，其中，所述微流控芯片包括依次相連的加樣孔、流動相孔、生成微滴乳 液的微通道、用于核酸擴(kuò)增及檢測的反應(yīng)腔及設(shè)于所述微流控芯片尾端的的反應(yīng)腔孔。
[0014] 優(yōu)選的是，其中，所述壓力驅(qū)動系統(tǒng)選用真空負(fù)壓系統(tǒng)時(shí)，真空負(fù)壓系統(tǒng)通過管路 與反應(yīng)腔孔相連，且所述真空負(fù)壓系統(tǒng)通過電磁閥控制其與所述反應(yīng)腔孔之間的連接，所 述管路末端與所述反應(yīng)腔孔之間通過橡膠圈壓緊密封;所述真空負(fù)壓系統(tǒng)與所述反應(yīng)腔孔 之間還設(shè)置有緩沖瓶。
[0015] 優(yōu)選的是，其中，所述加樣孔體積為5μ1~50μ1;所述流動相孔體積為40μ1~200μ 1;所述微通道寬度為1〇_~200μηι，所述微通道深度為1 Ομπι~200μηι;所述反應(yīng)腔深度為10μ m ~200μπι〇
[0016] 優(yōu)選的是，其中，所述基板層的材料選用玻璃、聚二甲基硅氧烷/聚甲基丙烯酸甲 酯/聚碳酸酯、聚四氟乙烯、耐熱透明膠帶、聚對苯二甲酸乙二醇酯膜中的一種;所述通道層 的材料選用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、玻璃或聚四氟乙烯中的一種； 所述蓋片層的材料選用玻璃、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯中的一種。
[0017] 優(yōu)選的是，其中，所述基板層、所述通道層及所述蓋片層層合方式為熱鍵合、耐熱 透明膠帶粘合、耐熱膠粘合或氧氣等離子體處理中的一種，層合后采用0.5~5%含氟硅烷 進(jìn)行表面疏水處理。
[0018]優(yōu)選的是，其中，所述通道層選用聚二甲基硅氧烷制成，所述基板層及所述蓋片層 表面在層合前需用聚二甲基硅氧烷預(yù)先包被處理。
[0019] 優(yōu)選的是，其中，所述壓力驅(qū)動系統(tǒng)為由注射栗驅(qū)動的正壓系統(tǒng)，所述正壓系統(tǒng)通 過管路與樣品孔和流動相孔分別相連，所述樣品孔及所述流動相孔與所述管路連接處通過 橡膠圈壓緊密封。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明針對上述數(shù)字等溫核酸檢測裝置還提供了以下使用方法，通過 以下步驟實(shí)現(xiàn)：
[0021] 步驟1、將目標(biāo)DNA分子同等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)試劑混合，加至樣品孔中，將含有氟化表面 活性劑的氟化油加至流動相孔中；
[0022] 步驟2、當(dāng)壓力驅(qū)動系統(tǒng)為真空負(fù)壓系統(tǒng)時(shí)，將真空負(fù)壓系統(tǒng)同反應(yīng)腔連接管路用 橡膠圈壓緊密封，抽真空，使真空度達(dá)到5~50kPa，待真空度穩(wěn)定后，打開電磁閥；
[0023]當(dāng)壓力驅(qū)動系統(tǒng)為注射栗正壓系統(tǒng)時(shí)，將注射栗正壓系統(tǒng)通過管路與樣品孔和流 動相孔相連，管路同樣品孔及流動相孔之間通過橡膠圈壓緊密封，打開注射栗開關(guān)；
[0024] 步驟3、樣品和氟化油在壓力作用下流動并通過流體剪切作用生成微滴，微滴在壓 力作用下進(jìn)入反應(yīng)腔，樣品全部生成微滴后，用耐熱膠帶將進(jìn)樣口和反應(yīng)腔口密封；
[0025] 步驟4、調(diào)節(jié)溫控系統(tǒng)使芯片溫度達(dá)到核酸擴(kuò)增合適溫度，保持合適溫度至核酸擴(kuò) 增結(jié)束；
[0026]步驟5、擴(kuò)增結(jié)束后，對微流控芯片反應(yīng)腔中微滴進(jìn)行熒光顯微拍照，通過軟件計(jì) 算陽性微滴與陰性微滴數(shù)目，計(jì)算目標(biāo)DNA拷貝數(shù)。
[0027]本發(fā)明至少包括以下有益效果：
[0028] 1)本發(fā)明將數(shù)字PCR技術(shù)同核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，克服了傳統(tǒng)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 無法準(zhǔn)確和絕對定量的問題；
[0029] 2)本發(fā)明利用微流控芯片集成化、微型化特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了樣品微滴制備、核酸擴(kuò)增及 檢測于一體，簡化了操作流程，有效防止了外界污染和核酸交叉污染；
[0030] 3)采用對反應(yīng)腔中微滴熒光拍照的方式檢測，同傳統(tǒng)流式檢測技術(shù)相比，速度更 快，對設(shè)備要求更低，便于分析設(shè)備的便攜化和微型化；
[0031] 4)本發(fā)明采用微滴作用核酸擴(kuò)增和檢測單元，同微孔式和微腔式相比，芯片結(jié)構(gòu) 簡單，降低了芯片設(shè)計(jì)加工難度；
[0032] 5)本發(fā)明結(jié)構(gòu)操作簡單，無需配套PCR儀器和數(shù)字PCR檢測系統(tǒng)，其應(yīng)用成本較目 前數(shù)字PCR儀器大大減少，可用于基層臨床檢測等。
[0033] 本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和