一種高產(chǎn)谷胱甘肽的釀酒酵母及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種釀酒酵母及其用途，具體涉及一株能高效 合成谷胱甘肽的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GSH-HS_001及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 谷胱甘肽(Glutathione，GSH)由谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸經(jīng)肽鍵縮合而成，是 生物體中最豐富的非蛋白類巰基化合物，廣泛存在于動植物組織及微生物細(xì)胞中。生物體 內(nèi)谷胱甘肽以兩種形式存在:還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)，而在機(jī)體中 大量存在并起作用的是GSIGSH分子中由于半胱氨酸上巰基(-SH)的存在，使GSH在生物體 內(nèi)有著多種重要的生理功能，主要為三個方面，如抗氧化、解毒和免疫調(diào)節(jié)。第一，GSH起著 維持生物體內(nèi)適宜氧化還原環(huán)境的作用，作為一種重要的抗氧化劑，GSH可以清除體內(nèi)氧自 由基(reactive oxygen species，R0S)，保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和其它生物分子不被氧化;第二， 作為解毒劑，半胱氨酸上的活性基團(tuán)巰基易與某些藥物、毒素、重金屬等結(jié)合，而具有整合 解毒作用;第三，可增強(qiáng)機(jī)體免疫能力，在高等真核細(xì)胞中，GSH可以迅速增強(qiáng)機(jī)體的免疫能 力。因此，谷胱甘肽在食品、醫(yī)藥、化妝品、發(fā)酵、飼料添加劑等領(lǐng)域具有廣泛的市場前景。
[0003] GSH的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、溶劑萃取法、酶轉(zhuǎn)化法和發(fā)酵法。其中，發(fā)酵法 是利用廉價的糖類、蛋白質(zhì)類原料，通過微生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑來進(jìn)行GSH合成的方 法。該法具有菌種易于培養(yǎng)、原料來源方便廉價、成本低、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)速率快等優(yōu)點， 已成為當(dāng)前生產(chǎn)GSH的主要方法。國外早在20世紀(jì)80年代就已實現(xiàn)了GSH的工業(yè)化生產(chǎn)，我 國由于起步較晚目前GSH的工業(yè)化生產(chǎn)仍未取得實質(zhì)性突破。
[0004] 在所有合成GSH的動植物細(xì)胞及微生物中，酵母是合成GSH最具潛力的微生物。與 此同時，酵母含有豐富的蛋白質(zhì)及維生素，在食品、醫(yī)藥、化妝品、發(fā)酵、飼料工業(yè)中早已廣 泛使用。利用發(fā)酵法生產(chǎn)富含谷胱甘肽的酵母均可作為上述工業(yè)的原料，同時提供豐富的 功能性有效成分GSH，對改善人體健康、提高動物機(jī)能等方面發(fā)揮重要作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是篩選一株能高效合成谷胱甘肽的酵母并利用該酵 母發(fā)酵制備富含谷胱甘肽的干酵母，有效解決酵母合成谷胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘 肽含量低的問題。本發(fā)明將擴(kuò)展富含谷胱甘肽干酵母的應(yīng)用范圍，有效提高產(chǎn)品的附加值。
[0006] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種釀酒酵母，其分類命名為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)GSH_HS-001，已于2015年12月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: Μ 2015724，地址：中國.武漢.武漢大學(xué)。
[0008] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的釀酒酵母是用于發(fā)酵培養(yǎng)富含谷胱甘肽的釀酒酵母。
[0009] 本發(fā)明所采用的釀酒酵母在制備富含谷胱甘肽的飼料添加劑、食品、藥品或化妝 品中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所采用的釀酒酵母在制備富含谷胱甘肽的干酵母中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明涉及的保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015724的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)GSH-HS_001具有如下優(yōu)點和顯著的進(jìn)步：
[0012] (1)篩選到的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GSH-HS_001合成谷脫甘肽的 能力強(qiáng)，發(fā)酵周期短，經(jīng)過鑒定遺傳背景清晰，無生物安全性隱患。
[0013] (2)經(jīng)過分批補(bǔ)料發(fā)酵及噴霧干燥所得的干酵母胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量高達(dá) 200~220mg/g，顯著高于已報道的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CCCG。有效解決 了酵母合成谷胱甘肽能力低及干酵母中谷胱甘肽含量低的問題。這將擴(kuò)展富含谷胱甘肽干 酵母的應(yīng)用范圍，有效提高產(chǎn)品附加值。
[0014] (3)通過搖瓶發(fā)酵所得酵母胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量為60~80mg/g，通過10L發(fā)酵 罐采用變速流加發(fā)酵所得酵母胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量為200~220mg/g，通過20立方發(fā)酵 罐采用變速流加發(fā)酵所得酵母胞內(nèi)還原型谷胱甘肽含量為200~220mg/g。
[0015] (4)酵母細(xì)胞膜和細(xì)胞壁起天然屏障作用減少谷胱甘肽的氧化，因而無需對谷胱 甘肽進(jìn)行提純，可與酵母細(xì)胞一起使用，這將極大的減少谷胱甘肽的損失與產(chǎn)品的成本。
【附圖說明】
[0016] 圖1是GSH-HS-001顯微鏡(400X)觀察照片；
[0017]圖2是GSH-HS-001平板菌落觀察照片。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明通過大量試驗從全國不同地區(qū)采集的不同樣本中反復(fù)進(jìn)行菌種篩選，最終 獲得了一株能高效合成谷胱甘肽的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GSH-HS_001，已 于2015年12月4日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，專利保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015724。
[0019] 菌株形態(tài)學(xué)特征:菌落呈乳白色，無光澤，扁平，大而厚，不透明，表面光滑，邊緣整 齊，濕潤粘膩，容易挑起，正反面、邊緣與中央部位顏色一致。
[0020] 菌株生理特性:可利用葡萄糖、蔗糖、麥芽糖等常見碳源。
[0021] 菌株代謝特性:代謝過程利用前體物質(zhì)高效合成谷胱甘肽。
[0022] 實施例一:高產(chǎn)谷胱甘肽菌種的篩選
[0023] (1)篩選樣本
[0024] 土壤、淡水、果實、植物、動物糞便等。
[0025] (2)培養(yǎng)基
[0026]富集培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖50，（NH4)2S〇4 2，KH2P〇4 2.5，MgS〇4.7H20 1，酵母膏0.5， pH 4.5，115°C滅菌30min;
[0027] 初篩平板培養(yǎng)基（g/L):葡萄糖50,尿素 l，（NH4)2S〇4 l，KH2P〇4 2.5，Na2HP〇4 0.5， MgS〇4.7H20 l，F(xiàn)eS〇4.7H20 0.1，酵母膏0.5,孟加拉紅0·03，ρΗ 4.5，瓊脂20，115°(3滅菌 30min；
[0028] 斜面培養(yǎng)基^/1):葡萄糖20，蛋白胨20，酵母膏1〇4!14.5，瓊脂20，115°〇滅菌 30min；
[0029] 種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母膏10，NaCl 5，pH 4.5~6.0，115°(3滅 菌30min;
[0030] 發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50,酵母膏 10,尿素4，（NH4)2S〇4 4，（NH4)2HP〇4 10，KH2P〇4 2.5，Na2HP〇4 0.5，MgS〇4.7H20 l，CaCl2l，pH 4.5~6.0，115°C滅菌30min;
[0031] 混合維生素溶液(g/L):維生素也1，維生素 B2 1，維生素 B3 1，維生素 B4 1，維生素 B6 3,泛酸鈣1;
[0032] 前體氨基酸溶液(g/L):谷氨酸鈉40，L-半胱氨酸鹽酸鹽40,甘氨酸10。
[0033] (3)富集培養(yǎng)
[0034] 取10g篩選樣本于100ml滅菌生理鹽水中，28~32°C下200~220rpm搖床振蕩1~2h 后取10ml菌液接種于富集培養(yǎng)基中，28~32°C、200~220rpm搖床振蕩培養(yǎng)36~42h。富集培 養(yǎng)3次。
[0035] (4)稀釋涂布
[0036]取富集培養(yǎng)液0.5mL于滅菌后的小試管內(nèi)，加入4.5ml無菌水，依次稀釋，分別得到 ΠΓ1到10-7等7個稀釋梯度。分別取10-5到10-7等3個梯度的稀釋菌液100μΙ于初篩平板培養(yǎng)基 上，涂布均勻，每個梯度分別做3個平行。28~32°C恒溫培養(yǎng)36~48h。
[0037] (5)平板劃線分純
[0038] 取稀釋涂布平板上菌落直徑較大，長勢較好的菌落分別編號并在瓊脂平板上劃線 分純，于28~32°C恒溫培養(yǎng)36~48h。劃線分純后挑選菌落直徑較大，生長較快的菌株轉(zhuǎn)接 于斜面培養(yǎng)基28~32°C恒溫培養(yǎng)36~48h后4°C冰箱保藏。初篩共計篩選到904個菌株。 [0039] (6)初篩菌株活化
[0040]斜面培養(yǎng)基滅菌備用，將初篩菌株轉(zhuǎn)接于試管斜面活化，28~32°C培養(yǎng)36~48h。
[0041] (7)種子液制備
[0042] 種子培養(yǎng)基分裝（100ml/500ml搖瓶)滅菌備用，取活化后的菌種轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng) 基中。28~32°C、200~220rpm搖床培養(yǎng)18~20h。
[0043] (8)接種發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵
[0044] 發(fā)酵培養(yǎng)基分裝（100ml/50()ml搖瓶)滅菌備用，取5mL混合維生素溶液及10ml種子 液(接種量8~10% )加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28~32°C、200~220rpm搖床培養(yǎng)。在搖床培養(yǎng)12h， 24h時分別補(bǔ)加30%葡萄糖溶液1511^，在搖床培養(yǎng)2411時補(bǔ)加151^前體氨基酸溶液，搖床培 養(yǎng)36~42h后結(jié)束發(fā)酵。
[0045] (9)酵母細(xì)胞破壁釋放谷胱甘肽
[0046] 取一定體積的菌液于離心管中，5000~8000rpm離心5~lOmin收集菌體，生理鹽水 洗