一種xl-2人肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系及用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種人肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個多階段、多步驟、多因素、多基因相互作用極其復(fù)雜的過程，自癌 細(xì)胞從瘤母體脫離到轉(zhuǎn)移灶形成要經(jīng)過黏附與解黏附、蛋白酶水解、運動等復(fù)雜過程和機 審IJ。在惡性腫瘤患者體內(nèi)，進入淋己管或血管的瘤細(xì)胞可W有很多，但是只有某些瘤細(xì)胞亞 群得W優(yōu)勢生長，獲得轉(zhuǎn)移表型，運些具有高轉(zhuǎn)移潛能的瘤細(xì)胞才易發(fā)生轉(zhuǎn)移。動物實驗也 證明：將T241肉瘤細(xì)胞移植于C57BL/6小鼠后，24小時在血液中就可查見活的瘤細(xì)胞，但到 第7天后方出現(xiàn)轉(zhuǎn)移；將放射性標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞注入動物血管中，進入血循環(huán)24小時后，能 夠存活的瘤細(xì)胞僅1%，而最后抵達(dá)某一部分產(chǎn)生繼發(fā)灶的不到0. 1%。
[0003] 目前，盡管國內(nèi)外由學(xué)者采用篩選的方法成功建立了高轉(zhuǎn)移模型，例如： Krasagakis等曾經(jīng)從皮膚神經(jīng)經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞癌的淋己結(jié)轉(zhuǎn)移灶中建立了癌細(xì)胞系。Lee等 從前列腺癌硬腦膜轉(zhuǎn)移灶中建立了癌細(xì)胞系。Seki等從人肝癌淋己結(jié)轉(zhuǎn)移灶中建立了一個 細(xì)胞系。但是，目前少見成功構(gòu)建理想的人肺癌體內(nèi)移植轉(zhuǎn)移模型的報道。因此本領(lǐng)域還 需要進一步研究開發(fā)出人肺癌高轉(zhuǎn)移模型及細(xì)胞系。
[0004] 另外目前經(jīng)過連續(xù)的體外人工培養(yǎng)傳代，很多腫瘤細(xì)胞已經(jīng)不能維持其最原始的 生物學(xué)特性。因此，使用運種腫瘤細(xì)胞建立的轉(zhuǎn)移模型其臨床預(yù)測能力較低。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽0化]本發(fā)明的目的在于提供一株人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。
[0006] 本發(fā)明另一目的在于提供該人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的用途。
[0007] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，簡稱化-2sci，其是W 常規(guī)肺癌細(xì)胞化-2細(xì)胞，經(jīng)動物體內(nèi)循環(huán)篩選獲得；所述人肺癌細(xì)胞化-2細(xì)胞在中國典 型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，保藏號為CCTCC NO C201282,中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、地址：中 國.武漢.武漢大學(xué)，保藏日期2012年6月19日。 W08] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的染色 體除了具有化-2細(xì)胞中出現(xiàn)的兩個染色體異位之外還具有另一個異位：deH9) 巧pter - pll: :lqll - qter);除此之外，XL-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中還有一個marker染色體。
[0009] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，所述人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的肺轉(zhuǎn)移率90 %。
[0010] 在本發(fā)明的第二方面，提供所述人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的用途，用于篩選肺癌 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。
[0011] 在本發(fā)明的第Ξ方面，提供一種篩選潛在的肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的方法，所述方法 包括如下步驟：將所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系與人肺癌細(xì)胞化-2中表達(dá)的基因比較， 選出所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中在統(tǒng)計學(xué)上表達(dá)上調(diào)的基因，該基因為潛在的肺 癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，該方法還包括：在所獲得的潛在的肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進行進一 步的細(xì)胞試驗和/或動物試驗，W選出對于肺癌的而轉(zhuǎn)移起確切作用的基因。
[0013] 在本發(fā)明的第四方面，提供所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的用途，用于篩選抗 腫瘤轉(zhuǎn)移藥物。
[0014] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0015] 圖1為化-2細(xì)胞上皮特性及染色體核型分析示意圖。
[0016] 圖2為化-2細(xì)胞II型肺泡起源及肺腺癌特點示意圖。
[0017] 圖3為第一、Ξ、五輪篩選獲得的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系體外遷移、侵襲能力比 較示意圖。
[0018] 圖4為化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞染色體核型分析示意圖。
[0019] 圖5為人肺癌化-2細(xì)胞與人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力比較示意圖。
[0020] 圖6為人肺癌化-2細(xì)胞與人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系之間侵襲、遷移、增殖能力的 比較示意圖。 陽02U 圖7為克隆形成實驗檢測人肺癌化-2細(xì)胞與人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系之間單個 細(xì)胞增殖能力示意圖。
【具體實施方式】
[0022] 本發(fā)明人經(jīng)過長期的研究和反復(fù)的篩選，找到一種肺癌轉(zhuǎn)移率高且惡性程度高的 人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系是一種理想的研究腫瘤轉(zhuǎn)移 的模型。基于此完成了本發(fā)明。人肺癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞腫瘤細(xì)胞存在一定的異質(zhì)性，它們之間 的轉(zhuǎn)移潛能存在差異。
[0023] 本發(fā)明進行反復(fù)的篩選，旨在找到轉(zhuǎn)移潛能高的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。
[0024] 與原發(fā)瘤細(xì)胞相比，經(jīng)篩選后的細(xì)胞可能有一些特殊的性狀賦予了它們特殊的轉(zhuǎn) 移能力。通過尋找運些機制，設(shè)計相應(yīng)的阻斷祀點，即可W抑制轉(zhuǎn)移。并且，經(jīng)過傳代篩選 后的高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞可W具有更強的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，易粘附、高產(chǎn)溶解酶W及具 有各種抗宿主免疫防御的特性，因而也更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。
[0025] 因此，本發(fā)明人從原發(fā)性腫瘤細(xì)胞出發(fā)，經(jīng)過多代篩選，找到了具有特殊高轉(zhuǎn)移能 力的腫瘤細(xì)胞亞系。具體而言，本發(fā)明所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系是通過W下方法、 經(jīng)過長期的分析和篩選而獲得的：將人肺癌化-2細(xì)胞移植至T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞缺陷的 N0D-SCID小鼠的皮下，待腫瘤長至足夠大時手術(shù)切除腫瘤，從小鼠體內(nèi)獲得肺轉(zhuǎn)移灶，然后 按細(xì)胞皮下接種一皮下腫瘤切除（僅限前Ξ輪篩選）一肺轉(zhuǎn)移灶一皮下移植一細(xì)胞建系反 復(fù)多代篩選得到自發(fā)性高轉(zhuǎn)移動物模型，同時建立相應(yīng)的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系。本發(fā)明將該細(xì)胞 系定名為人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系簡稱化-2sci，其是 W常規(guī)肺癌細(xì)胞化-2細(xì)胞，經(jīng)動物體內(nèi)循環(huán)篩選獲得；所述常規(guī)肺癌細(xì)胞化-2細(xì)胞在中 國典型培養(yǎng)物保藏中屯、保藏，保藏號為CCTCC NO C201282。
[0026] 在體外建立人癌細(xì)胞是研究人類腫瘤的一個重要手段。腫瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)建株 式一項難度較大的工程，原發(fā)瘤組織直接用于體外建系的成功幾率較低。本發(fā)明w新鮮的 經(jīng)過體內(nèi)5次反復(fù)篩選得到的人肺癌皮下高轉(zhuǎn)移模型的皮下移植瘤作為體外培養(yǎng)建系的 瘤源，一方面可W增強癌細(xì)胞的活力，另一方面可W使新建細(xì)胞系本身具有較高的轉(zhuǎn)移潛 能。在建系的過程中，本發(fā)明人不斷摸索和調(diào)整培養(yǎng)條件和培養(yǎng)方法，同時保證培養(yǎng)環(huán)境的 相對穩(wěn)定，成功地建立了人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系并存活。
[0027] 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示；所述的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞為典型的上皮樣細(xì)胞， 細(xì)胞生長速度較快，倍增時間為37. 10 + 4. 90小時，而人肺癌化-2細(xì)胞的倍增時間為 31. 92 + 2. 73 小時。
[0028] 染色體分析證實：人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞除了具有人肺癌化-2細(xì)胞中出現(xiàn)的兩 個染色體異位之外還具有另一個異位：deH9) (9pter - pll: : Iqll - qter);除此之外， 化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞中還有一個marker染色體。
[0029] 人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系應(yīng)用
[0030] 本發(fā)明還提供了人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系移植或人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系的用 途，包括但不限于用于：研究腫瘤（特別是肺癌）轉(zhuǎn)移和/或侵襲的機制；篩選潛在的肺癌 轉(zhuǎn)移相關(guān)基因；篩選抗腫瘤（特別是肺癌）轉(zhuǎn)移的藥物等。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種篩選潛在的肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因的方法，所述方法是將所述的 人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系中表達(dá)的基因與人肺癌化-2細(xì)胞中表達(dá)的基因比較，選出化-2 高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系在統(tǒng)計學(xué)上表達(dá)上調(diào)的基因，該基因因為潛在的肺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。
[0032] 在細(xì)胞中檢測相關(guān)基因的表達(dá)情況（或上調(diào)或下調(diào)）是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技 術(shù)，包括但不限于：基因忍片技術(shù)，免疫組織化學(xué)技術(shù)等，例如可將化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的基因 表達(dá)情況與人肺癌化-2細(xì)胞的相關(guān)基因表達(dá)進行比較，從而找出具有統(tǒng)計學(xué)意義差異表 達(dá)的基因。
[0033] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0034] (1)通過反復(fù)的體內(nèi)篩選，成功建立了人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系模型及人肺癌 化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，其轉(zhuǎn)移率高、轉(zhuǎn)移穩(wěn)定、直觀性好、祀向性強。
[0035] (2)利用本發(fā)明的人肺癌化-2高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系，為肺癌的防治研究及抗轉(zhuǎn)移治療提 供了理想的模型。
[0036] 下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇抑改希∟ew化；rK:Cold Spring化rbor L油oratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計算。
[0037] 1 材料 陽0測 1. 1標(biāo)本來源
[0039] 患者，男，45歲，06年于上海市瑞金醫(yī)院診斷為右肺腺癌，右上肺切除術(shù)后1年右 腎上腺、雙腎、兩肺、肝、后腹膜淋己結(jié)廣泛轉(zhuǎn)移，同時伴有大量腹水。于外科手術(shù)時取未污 染腹水標(biāo)本lOOmL用于細(xì)胞分離、培養(yǎng)。所有操作均遵循人類組織標(biāo)本使用原則。
[0040] 1.2實驗動物 陽OW SPF級雄性BALB/c裸鼠，鼠齡6-8w，體重18-22g，由上海市腫瘤研究所提供，生產(chǎn) 許可證號為SCXK(滬）2012-0001 ;所有小鼠均在屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)，飼料和水自由攝入，使用 許可證號為SYXK (滬）2012-0001。 W42] 1. 3 質(zhì)粒
[0043] pWP化-eGFP-2A-CBGr99質(zhì)粒、pA2包裝質(zhì)粒，pMDG2包膜質(zhì)粒由國家癌基因及相關(guān) 基因重點實驗室惠贈。皿101感受態(tài)細(xì)菌購自TAKARA公司。
[0044] 1.4主要抗體
[0045] 免疫組化實驗所用抗體，見表1。