Lamp技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)斡玫脑噭┖械闹谱鞣椒?br>【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)斡玫脑噭┖?，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 魚(yú)翅作為我國(guó)傳統(tǒng)的海產(chǎn)珍品，被譽(yù)為"海味八珍"之一，屬于高級(jí)滋補(bǔ)品，常與燕 窩、鮑魚(yú)、海參等相提并論，它是魚(yú)翅是整、經(jīng)、較的罐或尾端部分，經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜的加工 過(guò)程精制而成，主要產(chǎn)于日本、墨西哥、己西、非洲、中東、印度、南美洲及澳洲，我國(guó)的東海、 南海也有出產(chǎn)，但是我國(guó)是主要的進(jìn)口國(guó)，每年進(jìn)口約3500噸各種形式的魚(yú)翅。
[000引整魚(yú)隸屬于軟骨魚(yú)綱Chondrichthyes、板觸亞綱Elasmobranchii、整目 Selachoidei、星整屬M(fèi)ustelus，是海洋生物鏈中最高層的重要魚(yú)類，全世界共有整魚(yú)約370 種，可是用來(lái)割取魚(yú)翅的約20來(lái)種，由于其珍貴且稀有，加上市場(chǎng)對(duì)它的需求持續(xù)的增長(zhǎng)， 導(dǎo)致各類仿魚(yú)翅、參假魚(yú)翅等泛濫流行，極大地?cái)_亂了我國(guó)市場(chǎng)次序，極大地侵害了消費(fèi)者 的權(quán)益，甚至危害了消費(fèi)者的身體健康。急需研究靈敏度高且操作方便適合基層實(shí)驗(yàn)室檢 測(cè)的方法來(lái)打擊假冒偽劣魚(yú)翅產(chǎn)品，W保護(hù)消費(fèi)者的合法權(quán)益。
[0004]目前國(guó)內(nèi)外已有人報(bào)道用PCR和FINS方法來(lái)鑒定魚(yú)翅的種類，但存在PCR擴(kuò)增片段 過(guò)大難W擴(kuò)增出來(lái)，還有設(shè)計(jì)的引物范圍不寬，存在漏檢的可能，而且PCR方法需要昂貴儀 器設(shè)備，操作復(fù)雜。目前制備魚(yú)翅的主要整魚(yú)種類包括有準(zhǔn)頭沙KJ170949.1: Sphyrna lewini;JX827259.1，Sphy;rna lewini;HM239662.1 Sphyrna lewini、平滑鍵頭整 KM489157.1 Sphyrna zygaena、公牛整KF646785. ICarcharhinus leucas、灰色真整 KC470543. ICarcharhinus obscurus、黑翼整KJ720818. ICarcharhinus melanopterus、白 斑星整AB015962.1 Mustelus manazo、歐氏尖吻整抓528659.1 Hits址urina owstoni、海 洋白罐整4￥820736.1 0日1'油日1'11；[]1118 1〇叫;[1]1日]1113、褐星整抓099503.1 1113161113 116]116；[、 KJ010763.1 Mustelus henlei、沙虎整KF569943.1 Carcharias taurus、大青整 GU324148.1 Prionace glauca、關(guān)整KF111728.1 Galeocerdo cuvier、姥整KF597303.1 Cetorhinus maximus、灰星整KF889325.1 Mustelus griseus等整魚(yú)。
[000引目前已有的檢測(cè)方法，其檢測(cè)步驟繁瑣，采用儀器昂貴，不能快速、方便的實(shí)現(xiàn)鑒 別魚(yú)翅真?zhèn)?。故此，現(xiàn)有鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚臋z測(cè)方法有待進(jìn)一步完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真 偽用的試劑盒；
[0007] 采用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)畏椒ň哂锌焖?、檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、結(jié) 果直接可W判讀等特點(diǎn)。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下方案：
[0009] -種用于LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚脑噭┖?，其特征在于包括?LAMP反應(yīng)液緩沖液 0. 6mL 引物 250 μ L 巧光染料 50 μ L
[0010] 酶溶液 50 μ L 陽(yáng)性對(duì)照 50 μ L 去離子水 1000Μ1。
[0011] 如上所述的一種用于LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚脑噭┖?，其特征在于所述的引物?括：
[0012] 正向外引物尸3:5'-〔46641'170：了641^44了6-3'；
[0013] 反向外引物83:5'-6了6了644(：1^4641^4〔61'-3'；
[0014] 正向內(nèi)引物FIP:
[0015] 5 '-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3 '；
[0016] 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列：
[0017] Flc：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；
[0018] F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA [0019] 反向內(nèi)引物BIP:
[0020]日 '-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3 '
[0021 ] 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0022] Blc：TACGGCCTCGATGTTGGATC；
[002引 62:AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
[0024] 如上所述的一種用于LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚脑噭┖校涮卣髟谟谠撛噭┖挟a(chǎn)品 規(guī)格:45次。
[0025] -種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于包括W下步驟：
[0026] A、魚(yú)翅DNA的提取
[0027] 采用納米磁珠提取魚(yú)翅DNA;
[0028] B、建立LAMP反應(yīng)體系
[0029] 25化的LAMP反應(yīng)體系包括20化預(yù)反應(yīng)溶液和扣L DNA模板，其中20化預(yù)反應(yīng)溶液， 由W下組分組成： 2 X反應(yīng)緩沖液 12.日曲 引物 2-4化
[0030]巧光目視檢測(cè)試劑 1. 〇μL 酶溶液 1. 〇μL 去離子水 補(bǔ)齊至20 μι;
[0031 ] 所述引物的序列包括：
[0032] 正向外引物尸3:5'-〔46641'170：了641^44了6-3'；
[0033] 反向外引物83:5'-6了6了644(：1^4641^4〔61'-3'；
[0034] 正向內(nèi)引物FIP:
[00巧]5 '-AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC-AACCAAGTTACCCTAGGGATA-3 '；
[0036] 其中所述正向內(nèi)引物FIP包含F(xiàn)lc和F2序列：
[0037] Flc：AACCCTTTCTTCGATAGGGACTC；
[0038] F2：AACCAAGTTACCCTAGGGATA
[0039] 反向內(nèi)引物BIP:
[0040] 日 '-TACGGCCTCGATGTTGGATC-AGGACTGTTAATCGTTGAACAA-3 '
[0041 ] 所述反向內(nèi)引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0042] Blc：TACGGCCTCGATGTTGGATC；
[004引 62:AGGACTGTTAATCGTTGAACAA。
[0044] C、向Loopamp反應(yīng)試管中分別加入上述預(yù)反應(yīng)溶液各
[004引 D、在預(yù)反應(yīng)溶液中加入待檢測(cè)的待檢測(cè)樣品DNA化L，使總量達(dá)到2如レ
[0046] E、對(duì)照反應(yīng)中，陰性對(duì)照反應(yīng)使用普通經(jīng)魚(yú)DNA扣L，空白對(duì)照反應(yīng)使用去離子水 5化，陽(yáng)性對(duì)照使用魚(yú)翅本身提取的DNA^L
[0047] F、用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時(shí)離屯、；
[004引 G、將混合物置于LAMP濁度儀的反應(yīng)孔中，于60-70°C恒溫反應(yīng)90min，最后60-80°C 下保溫5minW結(jié)束反應(yīng)；
[0049] H、采用LAMP濁度儀方法或巧光目測(cè)的方法檢測(cè)檢驗(yàn)結(jié)果。
[0050] 如上所述的一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于所?正向外引物F3+ 反向外引物B3):(正向內(nèi)引物FIP+反向內(nèi)引物BIP)的濃度比為1:2-1:10。
[0051] 如上所述的一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于所述的FIP和BIP各 1.6μΜ，各40pmo1;F3和B3各0.2μΜ，各5pmo1。
[0052] 如上所述的一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于步驟A中所述的納米 磁珠提取魚(yú)翅DNA具體步驟：
[0053] 1)制樣:將不同魚(yú)翅樣品用錐刀磨碎，取磨碎樣品0.1-0.5g的魚(yú)翅組織加入1血抽 提緩沖液進(jìn)行研磨制成樣品；
[0054] 2)清洗納米磁珠:取出納米磁珠到PCR管中，用dd此0反復(fù)清洗納米磁珠 3次，在磁 鐵的作用下吸去dd出0;
[005引 3)結(jié)合:加入10化1的樣品至化CR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下 吸附；
[0056] 4)清洗:在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
[0057] 5)裂解:加入50化d地2昭化CR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95°C，lOmin;
[0058] 6)取樣:用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內(nèi)溶液澄清后，上清即為魚(yú)翅DM。
[0059] 如上所述的一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于所述的LAMP濁度儀方 法包括有實(shí)時(shí)濁度檢測(cè)和/或終點(diǎn)度檢測(cè)。
[0060] 如上所述的一種LAMP技術(shù)鑒別魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其特征在于所述巧光目測(cè)的方 法：
[0061] 使用紫外線照射裝置從試管底部向上進(jìn)行照射，佩戴紫外防護(hù)眼鏡從試管側(cè)面進(jìn) 行觀查；如果與陽(yáng)性對(duì)照一樣發(fā)出綠光，則判定為陽(yáng)性，如果與陰性對(duì)照一樣沒(méi)有發(fā)出巧 光，而判定為陰性。
[0062] 本發(fā)明采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增loop-mediated isothermal amplification,簡(jiǎn)稱 LAMP是一種新的核酸檢測(cè)方法，其原理是利用4個(gè)特殊設(shè)計(jì)的引物和具有鏈置換活性的DM 聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速地?cái)U(kuò)增DNA的新技術(shù)。該技術(shù)在1小時(shí)內(nèi)能擴(kuò)增出1〇9 祀序列拷貝，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出由不同大小的區(qū)帶組成的階梯式圖譜。傳統(tǒng) 的PCR技術(shù)，PCR結(jié)束后，需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳等方法進(jìn)行檢測(cè)，操作步驟繁 瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且存在漠化乙錠或同位素對(duì)人體和環(huán)境的危害。而本研究所建立的LAMP技 術(shù)檢測(cè)魚(yú)翅省時(shí)、經(jīng)濟(jì)且敏感性高。檢測(cè)結(jié)果只需利用LAMP濁度儀或者SYBG的綠色巧光或 通過(guò)目測(cè)是否產(chǎn)生白色沉淀就知道反應(yīng)是否發(fā)生，而不需要煩瑣的凝膠電泳檢測(cè)過(guò)程。
[0063] 綜上所述，本發(fā)明的有益效果：
[0064] 本發(fā)明采用磁珠法提取魚(yú)翅的DNA并根據(jù)魚(yú)翅整魚(yú)的線粒體C0I基因序列設(shè)計(jì)了 魚(yú)翅LAMP檢測(cè)的通用性特異性引物，通過(guò)對(duì)不同整魚(yú)類特異性檢測(cè)，建立了 LAMP方法鑒別 魚(yú)翅真?zhèn)蔚姆椒?，其絕對(duì)檢測(cè)限為lOfg/yL。本發(fā)明中引物特異性和通用性較好，靈敏度高； 本發(fā)明方法可成功檢測(cè)市售魚(yú)翅制品中真假鑒別提供了一種有效的技術(shù)手段。通過(guò)本體系 可W在一個(gè)小時(shí)內(nèi)高靈敏度的鑒別出魚(yú)翅的真?zhèn)?，檢測(cè)靈敏度達(dá)到lOfg。另外本發(fā)明方法 不需要昂貴的儀器和設(shè)備，只需要一個(gè)保溫箱即可，操作簡(jiǎn)單，結(jié)果直接可W判讀，非常適 合基層一線的使用，在食品滲假、非法添加的檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景和非常好的實(shí) 用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[006引圖1為本發(fā)明LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果；
[0066] 圖2為本發(fā)明LAMP靈敏度評(píng)價(jià)的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0067] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0068] 本發(fā)明W下實(shí)施例中所采用材料：
[0069] 1、各種魚(yú)翅實(shí)驗(yàn)樣品均購(gòu)自食品公司和商場(chǎng)。
[0070] 2、主要試劑
[0071] DNA 擴(kuò)增反應(yīng)試齊 Ij盒 Loopamp DNA Amplification kit, Loopamp? 朗報(bào) ?巧光目 視檢測(cè)試