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      一種檢測cyp2d6_g4180c基因多態(tài)性的引物與方法

      文檔序號:9745090閱讀:482來源:國知局
      一種檢測cyp2d6_g4180c基因多態(tài)性的引物與方法
      【技術(shù)領(lǐng)域】
      [0001 ] 本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體設(shè)及一種檢測CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的 引物與方法。
      【背景技術(shù)】
      [0002] CYP2D6是第一個被確認(rèn)由單基因控制的P450酶,CYP2D6是位于第22號染色體上, 其含有9個外顯子和8個內(nèi)含子,總長為化b左右,是一個完整的功能性基因。有研究發(fā)現(xiàn), CYP2D6基因上游有2個高度同源的假基因,分別稱為CYP2D7P基因和CYP2D8P基因,CYP2D7P 基因與CYP2D6基因有97%的核酸序列同源性,而且?guī)в蠺ATA盒,但是由于在外顯子1的第226 位點(diǎn)上插入了一個胸腺喀晚(T),從而改變了讀碼框架,使轉(zhuǎn)錄提前終止;CYP2D8P基因是一 個含有多個斷裂點(diǎn)的突變假基因。CYP2D7P和CYP2D8P基因在人體足跡中均不表達(dá),只有 CYP2D6在肝、腸、腎和人腦中表達(dá)。
      [0003] 現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),肝臟中CYP2D6的含量僅占 P450肝臟蛋白總量的2%,但是,它卻參與 代謝約25%的臨床用藥,包括抗抑郁藥、抗屯、律失常藥、抗精神病藥和鎮(zhèn)痛藥等。目前已發(fā)現(xiàn) 超過100種CYP2D6等位基因的變異,主要是單核巧酸變異、大片段基因的丟失W及多基因拷 貝,運(yùn)些變異使CYP2D6基因呈現(xiàn)多態(tài)性,并決定其代謝表型的多樣性,使酶的活性表現(xiàn)為缺 失、降低、正?;蚴窃黾拥葞追N類型。
      [0004] 楊軟等人發(fā)表了一篇題目為"CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬治療"的論文,該論文 表明不同基因型的CYP2D6對他莫昔芬的代謝不同,產(chǎn)生的活性代謝產(chǎn)物(4-徑基他莫昔芬 和化doxifen)濃度不同,其中PMs(含兩個無效等位基因致CYP2D6活性缺失)血漿中活性 代謝產(chǎn)物濃度最低,而UMs(含兩個W上正常功能等位基因,即多基因拷貝致CYP2D6活性增 強(qiáng))血漿活性代謝產(chǎn)物濃度最高。因此,CYP2D6J^多態(tài)性研究對臨床具有重要的意義,成為 目前研究的熱點(diǎn)。

      【發(fā)明內(nèi)容】

      [000引為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題,本發(fā)明提供一種檢測CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性 的引物與方法,該引物檢測CYP2D6基因 G4180C (rs 1135840)位點(diǎn),具有特異性好、靈敏度 高、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn),為CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性提供了一種簡單有效的檢測方法。
      [0006]本發(fā)明提供了一種檢測CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的引物,包括巢式PCR擴(kuò)增引物 和挪aPshot PCR引物;所述巢式PCR擴(kuò)增引物包括巢式A輪PCR擴(kuò)增引物和巢式B輪PCR擴(kuò)增 引物;所述巢式A輪擴(kuò)增引物為:針對CYP2D6的上游引物5 ' - CCAGAAGGCTTTGCAGGCTTCA-3 ' (沈Q ID N0.1)和下游引物5'- CTGAGCCCTGGGAGGTAGGTAG-3'(沈Q ID 側(cè).2);所述巢式8輪 PCR擴(kuò)增引物為:針對CYP2D6_G4180C的上游引物5 ' -GCAGCACTTCAGCTTCTCG -3 '(SEQ ID N0.3)和下游引物5'-TACCCCTGTCTCAAATGCG-3'(SEQIDN0.4);所述SNaPshotPCR引物 為:針對 CYP2D6_G4180C 的 SNaPshot PCR 弓| 物 5' TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACCATGGTGTCT-3 '(SEQ ID NO.5)。
      [0007]另外,本發(fā)明還提供了一種檢測CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的方法,包括如下步 驟: S1提取DNA樣品; S2采用權(quán)利要求1所述的巢式A輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,對巢式A輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行純化; S3W巢式A輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板采用權(quán)利要求1所述的巢式B輪PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行多重 PCR擴(kuò)增; S4采用權(quán)利要求1所述的挪aPshot PCR引物進(jìn)行挪aPshot PCR擴(kuò)增,對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 純化; S5毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行檢測,對檢測結(jié)果進(jìn)行分析,確定SNP位點(diǎn)及其基因型。
      [000引進(jìn)一步地,所述步驟S1中的DNA樣品為邸TA抗凝外周血的DNA樣品。
      [0009]進(jìn)一步地,所述步驟S2中的巢式A輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階 段2:98°C 10s;階段3:72°C 3min;階段4:返回到階段2,24個循環(huán);階段5:72°C 5min;階段 6:25°C 保溫。
      [0010]進(jìn)一步地,所述步驟S3中的巢式B輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:98°C 3min;階 段2:98°C 10s;階段3:58°C 30s;階段4:72°C Imin;階段5:返回到階段2,29個循環(huán);階段6: 72°C 5min;階段7:25°C 保溫。
      [0011] 進(jìn)一步地,所述步驟S4中的挪aPshot PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件包括:階段1:96°C 10s;階 段2:55°C 5s;階段3:60°C 30s;階段4:返回到階段1,25個循環(huán);階段5:4°C保溫。
      [001引進(jìn)一步地,所述步驟S5中采用GENEMAPP邸ID V4.1軟件對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。
      [0013] 除此之外,本發(fā)明提供的CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的引物在制備檢測CYP2D6_ G4180C基因多態(tài)性試劑中的用途。
      [0014] 與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有W下優(yōu)勢:本發(fā)明提供了一種檢測 CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的引物,該引物的特異性好,不會發(fā)生交叉反應(yīng),準(zhǔn)確性好,實(shí)現(xiàn) 了 CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的檢測,對實(shí)現(xiàn)基因?qū)蛐詡€體化治療,不斷提高治療效果、 降低不良反應(yīng)具有非常重要的意義。
      【附圖說明】
      [001引圖巧本發(fā)明提供的CYP2D6_G4180C的擴(kuò)增片段; 圖2為CYP2D6_G4180C引物擴(kuò)增產(chǎn)物的部分測序圖; 圖3為樣品的CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性檢測結(jié)果圖。
      【具體實(shí)施方式】
      [0016] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
      [0017] 實(shí)施例一、引物 本發(fā)明提供的引物如表1所示,包括巢式PCR擴(kuò)增引物和挪aPshot PCR引物;所述巢式 PCR擴(kuò)增引物包括巢式A輪PCR擴(kuò)增引物和巢式B輪PCR擴(kuò)增引物,所述巢式B輪PCR擴(kuò)增引物 和挪aPshot PCR引物是相對應(yīng)的。本發(fā)明提供的所有引物序列均通過UCSC數(shù)據(jù)庫比對,無 已知SNP位點(diǎn)。
      [0018]表1本發(fā)明提供的引物
      實(shí)施例二、引物的特異性 將本發(fā)明提供的引物于UCSC中進(jìn)行Blasting,結(jié)果如下: CYP2D6_G4180C基因特異引物于UCSC中進(jìn)行Blast,無其它同源基因。CYP2D6_G4180C擴(kuò) 增片段位于C虹22:42126391-42126685,長度為29化P,擴(kuò)增序列如圖1。
      [0019]使用表1中PCR擴(kuò)增引物分別對檢測樣品進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測序,測序結(jié)果顯示, 各引物擴(kuò)增片段與CYP2D6_G4180C基因參考序列吻合,結(jié)果如圖2所示。使用表1中挪aPshot PCR引物,SNaPshot法進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖3所示。從圖3可知,各產(chǎn)物峰的相對位置及測序反 應(yīng)滲入的堿基與預(yù)期相符,且無其它干擾峰。
      [0020] 實(shí)施例S、CYP2D6_G4180C基因多態(tài)性的檢測 1)提取抓TA抗凝外周血的DNA樣品,提取方法參照TIANamp Blood DNA Kit(購自 Τ iagen,貨號DP318 )的說明書,將DM樣品稀釋至1 OOng/yL,備用。
      [0021 ] 2)配制引物混合物:配制巢式A輪PCR引物混合物,CYP2D6-Fwd: CYP2D6-Rev:肥0= 1:1:3,引物終濃度為1 pmolAiL,震蕩混勻,短暫離屯、后備用;配制B輪PCR引物混合物,引物 終濃度為0.5 pmol/μレ短暫離屯、后備用;PCR擴(kuò)增采用Q5?熱啟動超保真2X Master M
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