基因表達(dá)或活性增強(qiáng)性元件的制作方法
【專利說(shuō)明】基因表達(dá)或活性增強(qiáng)性元件
[0001] 本申請(qǐng)要求2013年7月5日提交的申請(qǐng)?zhí)朎P 13175398.0的優(yōu)先權(quán)，所述專利申請(qǐng) 通過引用方式完整并入本文作為參考。本發(fā)明設(shè)及轉(zhuǎn)基因核酸、表達(dá)盒、載體、植物細(xì)胞、植 物器官和植物。本發(fā)明還設(shè)及用于增加、尤其在植物細(xì)胞或植物器官中增加祀基因表達(dá)或 活性的方法，并且還設(shè)及重組核酸和表達(dá)盒增加祀基因表達(dá)或活性的用途或用于制備載 體、植物細(xì)胞、植物器官或植物的用途。另外，本發(fā)明設(shè)及用于實(shí)現(xiàn)、尤其在植物細(xì)胞或植物 器官中與運(yùn)種植物細(xì)胞、植物器官或植物中有功能的啟動(dòng)子有效連接時(shí)實(shí)現(xiàn)祀基因的增加 表達(dá)或活性的增強(qiáng)子。本發(fā)明在此參考生產(chǎn)多不飽和脂肪酸(PUFA)的技術(shù)領(lǐng)域來(lái)描述，但 不限于運(yùn)個(gè)技術(shù)領(lǐng)域。
[0002] 為了在植物細(xì)胞中產(chǎn)生所需分子例如PUFA，經(jīng)常需要表達(dá)相對(duì)于植物細(xì)胞為異源 的祀基因，或需要過量表達(dá)天然存在于所述植物細(xì)胞中的祀基因。
[0003] W0 02/102970公開了從亞麻獲得的兩個(gè)Conlinin基因 （Conlinin 1和2)及它們的 相應(yīng)啟動(dòng)子區(qū)，它們可W用來(lái)改善種子性狀、調(diào)節(jié)種子油的脂肪酸組成和種子膽藏蛋白的 氨基酸組成，及在植物種子中產(chǎn)生生物活性化合物。該文獻(xiàn)還提到基于利用運(yùn)些啟動(dòng)子指 導(dǎo)目的基因的種子特異性表達(dá)的方法，所述目的基因例如可能參與脂質(zhì)生物合成，例如酷 基載體蛋白、飽和酶、去飽和酶和延伸酶。
[0004] W0 01/16340公開了允許異源基因在亞麻和其他植物中種子特異性表達(dá)的方法。 與脂肪酸代謝如酷基載體蛋白、飽和酶、去飽和酶和延伸酶等相關(guān)的啟動(dòng)子特別有意義。 [000引啟動(dòng)子功能在于啟動(dòng)DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA。通常，轉(zhuǎn)錄的mRNA包含翻譯區(qū)，也稱作基因 序列，及其上游的非翻譯區(qū)。通常認(rèn)為運(yùn)種非翻譯區(qū)對(duì)基因序列的翻譯或mRNA的穩(wěn)定性不 造成任何重大影響。因此，在啟動(dòng)子TATA框和起始密碼子之間的區(qū)域通常情況下作為非重 要部分處理。例如，WOO 1/16340公開了一種推定的conlinin啟動(dòng)子，但是該文獻(xiàn)中公開的 GUS表達(dá)構(gòu)建體(本文作為SEQ ID NO.311復(fù)制)僅在推定的啟動(dòng)子序列的3M則縮短。
[0006] 開發(fā)改進(jìn)型農(nóng)藝性狀持續(xù)需要找到能改善祀基因在目的細(xì)胞中表達(dá)或活性的增 強(qiáng)子遺傳元件。具體而言，產(chǎn)生修飾的種子油脂肪酸組成的油巧作物是一項(xiàng)要求鑒定其他 增強(qiáng)性元件的需求;優(yōu)選地，進(jìn)一步需要改善脂肪酸生物合成基因表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0007] 現(xiàn)在已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，某些核酸可W在祀基因或報(bào)道基因與啟動(dòng)子有效連接 時(shí)改善該基因的表達(dá)或活性。
[0008] 應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明不限于如描述那樣的具體方法學(xué)、方案、細(xì)胞系、植物物種或?qū)佟?構(gòu)建體和試劑。還應(yīng)當(dāng)理解本文所用的術(shù)語(yǔ)目的僅在于描述具體實(shí)施方案，并且不意圖限 制本發(fā)明，本發(fā)明將僅受所附權(quán)利要求書限制。
[0009] 必須指出，除非上下文另外明確指出，否則如本文中和所附權(quán)利要求中所用，單數(shù) 形式"一個(gè)"、"一種"和"該"包括復(fù)數(shù)稱謂。因此，例如，對(duì)"一種載體"的稱謂是對(duì)一種或多 種載體的稱謂并且包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其等同物等。術(shù)語(yǔ)"約"在本文中用來(lái)指大 約、大致、左右和在……范圍內(nèi)。當(dāng)術(shù)語(yǔ)"約"與一個(gè)數(shù)字范圍聯(lián)合使用時(shí)，它通過擴(kuò)展界限 值高于和低于所述數(shù)值而修飾該范圍。通常而言，術(shù)語(yǔ)"約"在本文中用來(lái)通過20%、優(yōu)選地 10%之上或之下（更高或更低)變異而修飾高于和低于所述值的數(shù)值。如本文中所用，詞匯 "或"意指特定列出的任一成員并且還包括該列出的成員的任意組合。
[0010] 為了克服、減少或緩和前述缺點(diǎn)和/或?yàn)榱诉M(jìn)一步實(shí)現(xiàn)前述目的和/或改善前述的 優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含祀基因和郵鄰于該祀基因的非翻譯區(qū)，其中非翻譯 區(qū)包含至少18個(gè)連續(xù)核巧酸的增強(qiáng)子，其中至少14個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧。
[0011] 從另一方面描述本發(fā)明時(shí)，本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含植物啟動(dòng)子和郵鄰 于該啟動(dòng)子的非翻譯區(qū)，其中非翻譯區(qū)包含至少18個(gè)連續(xù)核巧酸的增強(qiáng)子，其中至少14個(gè) 核巧酸是腺巧或胞巧。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種增強(qiáng)子，其包含
[0013] a)CCAAT框，其包含沈Q ID NO. 100、優(yōu)選地包含與沈Q ID NO. 101具有至少90%同 一性的序列并包含SEQ ID NO. 100,并且更優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 101，和/或
[0014] 6)0〇門/]^81曰結(jié)合位點(diǎn)，其包含沈9 10顯.102、優(yōu)選地包含與569 10^.103具 有至少90%同一性的序列并包含沈Q ID NO. 102,并且更優(yōu)選地包含沈Q ID NO. 103。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，還提供了一種表達(dá)盒，其包含本發(fā)明的重組核酸并且如果尚未包含 于該重組核酸中，則包含植物啟動(dòng)子，其中該啟動(dòng)子包含
[0016] TATA框，其優(yōu)選地包含沈Q ID NO. 108、更優(yōu)選地包含與沈Q ID NO. 107具有至少 90%同一性的序列并包含沈Q ID NO. 108,并且更優(yōu)選地包含沈Q ID NO. 107,和
[0017] CPRF因子結(jié)合位點(diǎn)，其優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 114、更優(yōu)選地包含與SEQ ID NO. 113具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 114,并且更優(yōu)選地包含SEQ ID NO.113,和
[0018] TCP I類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 116、更優(yōu)選地包含與SEQ ID NO. 115具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 116,并且更優(yōu)選地包含SEQ ID NO.115,和
[0019] bZIP蛋白G框結(jié)合因子1結(jié)合位點(diǎn)，其優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 118、更優(yōu)選地包含與 沈Q ID NO. 117具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 118,并且更優(yōu)選地包含沈Q ID NO.117。
[0020] 本發(fā)明也提供一種包含本發(fā)明表達(dá)盒的載體。
[0021] 另外，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的重組核酸的或本發(fā)明的表達(dá)盒的植物、植物器官 或植物細(xì)胞。
[0022] 本發(fā)明還教授一種增加祀基因表達(dá)或活性的方法，所述方法包括步驟
[0023] i)在祀基因上游提供非翻譯區(qū)和植物啟動(dòng)子W獲得根據(jù)權(quán)利要求9至11中任一項(xiàng) 所述的表達(dá)盒，和
[0024] i i)向植物細(xì)胞引入表達(dá)盒W允許祀基因表達(dá)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，如本文所述的本發(fā)明增強(qiáng)子或本發(fā)明的表達(dá)盒可W用于
[0026] -增加祀基因表達(dá)或活性，
[0027] -產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求15所述的載體，或用于
[0028] -產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求16所述的植物、植物器官或植物細(xì)胞。
[0029] 下文更詳細(xì)地描述本發(fā)明。除非另外特別聲明，否則，"定義"章中的各定義適用于 本文本各處。
[0030] 發(fā)明詳述
[0031] 看待本發(fā)明的一種方式是如下理解本發(fā)明：根據(jù)本發(fā)明，提供了一種重組核酸，所 述核酸包含祀基因和郵鄰于祀基因的非翻譯區(qū)。根據(jù)本發(fā)明，非翻譯區(qū)包含至少18個(gè)連續(xù) 核巧酸的增強(qiáng)子，其中至少14個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧。
[0032] 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，核酸的特定區(qū)段-下文將描述其優(yōu)選實(shí)施方案-作為增強(qiáng)子在宿 主細(xì)胞、尤其植物細(xì)胞中發(fā)揮作用，即，可W通過報(bào)道基因與該增強(qiáng)子有效連接增加祀基因 或報(bào)道基因產(chǎn)物的活性。增強(qiáng)子和祀基因因此是功能性連接的，即增強(qiáng)子影響或修飾祀基 因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。借助本發(fā)明增強(qiáng)子增加活性可W通過宿主細(xì)胞增加 mRNA的產(chǎn)生來(lái)實(shí)現(xiàn)， 或可W通過增加 mRNA翻譯速率(例如通過改善核糖體與該mRNA的結(jié)合或通過保護(hù)該mRNA免 受降解)來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，本發(fā)明不限于運(yùn)些機(jī)制中的任一者。
[0033] 增強(qiáng)子優(yōu)選地相對(duì)于祀基因和/或驅(qū)動(dòng)祀基因表達(dá)的啟動(dòng)子為異源。因此，W下序 列不是本發(fā)明的部分:特別包含于W0 0116340、W0 2002102970、W0 2009130291中的沈Q ID NO.311至323。
[0034] 祀基因可W是需要在植物中增加其活性的任何基因。通過比較不與增強(qiáng)子功能性 連接情況下相同類型細(xì)胞(例如種子細(xì)胞，根細(xì)胞等）中表達(dá)的祀基因的活性，確定增加作 用。有用祀基因的例子是脂肪酸去飽和酶基因和脂肪酸延伸酶基因，尤其dl2dl5Des(Ac_ GA)(參見WO 2007042510)、dl2Des(Ce_GA)(參見US 2003172398)、dl2Des(Co_GA2)(參見WO 200185968)、dl2Des(Fg)(參見WO 2007133425)、dl2Des(Ps_GA)(參見WO 2006100241)、 dl2Des(Tp_GA)(參見WO 2006069710)、d6Des(01_febit)(參見WO 2008040787)、d抓es(0I_ febit)2(參見WO 2008040787)、d6Des(0t_febit)(參見WO 2008040787)、d6Des(0t_GA)(參 見 WO 2005083093)、d6Des(0t_GA2)(參見 WO 2005083093)、d6Des(Pir)(參見 WO 2002026946)、d抓es(Pir_GAI)(參見WO 2002026946)、d抓es(Plu)(參見WO 2007051577)、 d6Elo(化_GA)(參見WO 2001059128)、d6Elo(化_GA2)(參見WO 2001059128)、d6Elo(化_ GA3)(參見WO 2001059128)、d6Elo(Tp_GA)(參見WO 2005012316)和d6Elo(Tp_GA2)(參見WO 2005012316)。
[0035] 增強(qiáng)子包含于郵鄰于祀基因的非翻譯區(qū)內(nèi)或形成所述非翻譯區(qū)。對(duì)于本發(fā)明，如 果除了屬于祀基因的區(qū)域之外的未翻譯區(qū)域位于包含增強(qiáng)子或由增強(qiáng)子組成的非翻譯區(qū) 和祀基因之間，則非翻譯區(qū)視為郵鄰于祀基因。因此，例如，在祀基因包含幾個(gè)外顯子的情 況下，當(dāng)非翻譯區(qū)如此位于第一外顯子上游，從而未翻譯區(qū)域位于包含或作為增強(qiáng)子的非 翻譯區(qū)和第一外顯子之間時(shí)，非翻譯區(qū)視為與祀基因郵鄰存在。為了本發(fā)明，外顯子按5/至 3/方向計(jì)數(shù)，從而第一外顯子是包含祀基因起始密碼子的一個(gè)外顯子。
[0036] 應(yīng)當(dāng)指出，除本發(fā)明的增強(qiáng)子之外，非翻譯區(qū)還可W包含其他功能單位，包括轉(zhuǎn)錄 或翻譯增強(qiáng)序列。無(wú)論非翻譯區(qū)是否包含運(yùn)類其他功能單位，出于本發(fā)明目的，未翻譯區(qū)域 與祀基因在前述條件下郵鄰存在，即，未翻譯的區(qū)域位于非翻譯區(qū)和祀基因之間。優(yōu)選但不 要求本發(fā)明的增強(qiáng)子本身郵鄰于祀基因的翻譯起始密碼子。
[0037] 非翻譯區(qū)可W在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄或可W在細(xì)胞中不轉(zhuǎn)錄。特別地，非翻譯區(qū)可W包含 被轉(zhuǎn)錄但不翻譯的翻譯增強(qiáng)序列或mRNA穩(wěn)定性增強(qiáng)序列。
[0038] 非翻譯區(qū)和增強(qiáng)子優(yōu)選地位于祀基因上游。如果將祀基因的核堿基從1開始對(duì)第 一個(gè)所翻譯密碼子的5 '最末端核堿基(通常，DNA序列的密碼子"ATG"的"A"與祀基因 mRNA的 "AUG"相對(duì)應(yīng))編號(hào)并且按3'方向遞增數(shù)字，則增強(qiáng)子的核堿基將按負(fù)數(shù)字命名，因?yàn)榉欠?譯區(qū)優(yōu)選地位于祀基因的5'方向。
[0039] 特別優(yōu)選非翻譯區(qū)按5/至3/方向包含本發(fā)明的增強(qiáng)子和一個(gè)或多個(gè)其他功能單 位、尤其一個(gè)或多個(gè)肥ΕΝΑ或RENA，如在例如W0 2013038294中所述那樣。
[0040] Kozak序列優(yōu)選地位于非翻譯區(qū)和祀基因的交界處。優(yōu)選地，Kozak序列包含核巧 酸序列"ATGG"，其中"ATG"是祀基因的起始密碼子。Kozak序列促進(jìn)祀基因的翻譯。技術(shù)人員 可W根據(jù)意圖使用的細(xì)胞并且還根據(jù)祀基因的表達(dá)需要來(lái)改編Kozak序列的正合核巧酸序 列。例如，技術(shù)人員可W產(chǎn)生序列"NNATGNN"的全部256種變體，其中"N"指任何核堿基"A、C、 G或r，并且克隆運(yùn)些變體于他意圖使用的細(xì)胞中。通過分析祀基因的活性，他將找到對(duì)于 其需要而言最佳的Kozak序列。如果第二氨基酸對(duì)祀基因發(fā)揮功能重要，可W顯著減少變體 數(shù)目，因?yàn)樵谶\(yùn)種情況下"ATG"起始密碼子后（即，按3 '方向）的至少第一個(gè)核巧酸限于一種 或兩種備選物。優(yōu)選的Kozak序列是乂CATGG"，因?yàn)檫\(yùn)個(gè)序列還由限制性酶化〇1或Bspl9I識(shí) 另IJ，由此促進(jìn)克隆與非翻譯區(qū)郵鄰的祀基因。出于本發(fā)明目的，將前面的乂C'核堿基視為屬 于非翻譯區(qū)。
[0041] 本發(fā)明的增強(qiáng)子包含至少18個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成。該增強(qiáng)子因此不被任何其 他元件中斷，無(wú)論所述其他元件是功能性元件或無(wú)功能元件。如下文所描述，增強(qiáng)子及還有 非翻譯區(qū)可W實(shí)質(zhì)上長(zhǎng)于18個(gè)核巧酸，并且優(yōu)選地，增強(qiáng)子由如下文描述的57個(gè)或58個(gè)連 續(xù)核巧酸組成。
[0042] 本發(fā)明的增強(qiáng)子具有幾種有益特征。其一是，與其他表達(dá)誘導(dǎo)序列如例如W0 2011023537、W0 2011023539、W0 2011023800或W0 2013/005152中所述的肥ΕΝΑ相比，該增 強(qiáng)子序列短。該增強(qiáng)子因此還可W輕易并入受到嚴(yán)重尺寸限制的運(yùn)類構(gòu)建體中，例如原因 在于待并入相應(yīng)構(gòu)建體的基因的個(gè)數(shù)和/或大小。
[0043] 另外，已經(jīng)顯示該增強(qiáng)子對(duì)龐大數(shù)目的不同祀基因、尤其對(duì)序列高度不同的飽和 酶基因和延伸酶基因有活性。因此，本發(fā)明提供用于植物中的通用型增強(qiáng)子。
[0044] 另外，本發(fā)明的增強(qiáng)子不僅在擬南芥中有功能，還在其他植物、尤其如下文描述的 作物植物中、尤其在十字花科（Brassicaceae)的植物細(xì)胞中有作用、甚至在蕓苔屬 (8'曰3 3；[。日）的植物細(xì)胞中更有作用^及甚至尤其在歐洲油菜（13^3 3；[。3]1日9113)、甘藍(lán) (Brassica oleracea)、埃塞俄比亞芥（Brassica ca;rina1:a)、黑芥（Brassica nigra)、芥菜 (Brassica juncea)和憲青(Brassica rapa)的細(xì)胞中更有作用。
[0045] 本發(fā)明增強(qiáng)子的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它可用于增加在種子特異性啟動(dòng)子控制下表達(dá)的 祀基因的表達(dá)或活性。特別地，本發(fā)明的增強(qiáng)子可W與Conlinin型啟動(dòng)子組合W實(shí)現(xiàn)種子 特異性表達(dá)，如W0 2002102970中所述。但是，本發(fā)明的增強(qiáng)子也可W與其他啟動(dòng)子組合W 增加祀基因的表達(dá)或活性。
[0046] 本發(fā)明的非翻譯區(qū)或增強(qiáng)子優(yōu)選地包含根據(jù)SEQ ID N0.84、85、86、87、88或89的 任何核巧酸序列。特別優(yōu)選非翻譯區(qū)或增強(qiáng)子包含一個(gè)或多個(gè)前述序列的兩個(gè)拷貝。根據(jù) SEQ ID ^.84、85、86、87、88或89的核巧酸序列可^在非翻譯區(qū)或增強(qiáng)子中^重疊形式存 在。例如，兩個(gè)胞巧后接五個(gè)腺巧核堿基的核巧酸序列將同時(shí)地體現(xiàn)根據(jù)SEQ ID NO: 85、86 和87的序列。
[0047] 特別優(yōu)選該增強(qiáng)子包含根據(jù)SEQ ID NO.84的核巧酸序列。運(yùn)個(gè)序列包含植物啟動(dòng) 子中存在的植物CCAAT框的核屯、基序SEQ ID NO. 100。因此，根據(jù)SEQ ID NO.84的序列的存 在特別合適實(shí)現(xiàn)與運(yùn)個(gè)序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子的作用。特別優(yōu)選該增強(qiáng)子或非翻譯區(qū)包含由 DNA螺旋中大約5個(gè)轉(zhuǎn)角分隔的兩個(gè)SEQ ID NO.84拷貝，即，包含該增強(qiáng)子或非翻譯區(qū)的DNA 序列優(yōu)選地包含由52、53、54、55、56、57或58個(gè)核巧酸分隔的兩個(gè)SEQ ID NO.84范例，所述 52、53、54、55、56、57或58個(gè)核巧酸從SEQ ID NO. 84的第一范例的第1個(gè)核巧酸（即5 '最末 端)按5'方向計(jì)數(shù)至SEQ ID NO.84的第二范例前方的最末核巧酸，優(yōu)選地它們由54、55或56 個(gè)核巧酸和最優(yōu)選地由55個(gè)核巧酸分隔。例如，在根據(jù)SEQ ID NO. 143的核巧酸序列中，非 翻譯區(qū)的SEQ ID NO.84范例由55個(gè)核巧酸分隔。
[0048] 還特別優(yōu)選增強(qiáng)子如此與啟動(dòng)子功能性連接，從而增強(qiáng)子可W在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。下 文更詳細(xì)地描述本發(fā)明的運(yùn)個(gè)方面。在運(yùn)種情況下，特別優(yōu)選增強(qiáng)子包含至少一個(gè)SEQ ID NO. 84拷貝或范例。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明，增強(qiáng)子優(yōu)選地包含18個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少15個(gè)、優(yōu)選 地至少17個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多1個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。 運(yùn)類增強(qiáng)子的優(yōu)選實(shí)施方案在沈Q ID NO. 20至SEQ ID NO.45中描述。運(yùn)些序列當(dāng)中，優(yōu)選 根據(jù)沈0 1〇^.20、22、25、28、34、35和36的序列，因?yàn)樗鼈儼?60 1〇^.84范例。特別優(yōu) 選是根據(jù)SEQ ID NO. 25的序列，因?yàn)檫\(yùn)個(gè)序列包含SEQ ID NO. 84、100和101的全部并且因 此十分類似于植物CCAAT框。
[0050] 還優(yōu)選的是增強(qiáng)子包含21個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少15個(gè)、優(yōu)選地至少 16個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多2個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。相應(yīng)的 優(yōu)選序列由560 1〇顯.95及由560 1〇^.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中 任一者的最后21個(gè)核巧酸給出。
[0051] 還優(yōu)選的是增強(qiáng)子包含22個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少16個(gè)、優(yōu)選地至少 17個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多2個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。運(yùn)種序 列的優(yōu)選范例由SEQ ID N0.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后 22個(gè)核巧酸給出。
[0052] 還優(yōu)選的是增強(qiáng)子包含24個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少18個(gè)、優(yōu)選地至少 19個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多3個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。運(yùn)種序 列的優(yōu)選范例由SEQ ID N0.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后 24個(gè)核巧酸給出。
[0053] 還優(yōu)選的是增強(qiáng)子包含36個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少27個(gè)、優(yōu)選地至少 28個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多6個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。運(yùn)種序 列的優(yōu)選范例由560 1〇顯.96及由560 1〇^.46、96、161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后36個(gè)核巧酸給出。
[0054] 還優(yōu)選的是增強(qiáng)子包含57個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少42個(gè)、優(yōu)選地至少 45個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多8個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。運(yùn)類增 強(qiáng)子的優(yōu)選例子由沈0 1〇側(cè).46至83的任一者給出及由沈0 1〇側(cè).46、161-170、221-230、 276-285和301-310中任一者的最后57個(gè)核巧酸給出。
[0055] 還優(yōu)選的是增強(qiáng)子包含83個(gè)連續(xù)核巧酸或由其組成，其中至少62個(gè)、優(yōu)選地至少 65個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧，并且最優(yōu)選地最多8個(gè)核巧酸既不是腺巧，也不是胞巧。運(yùn)種序 列的優(yōu)選范例由沈Q ID N0.161-170、221-230、276-285和301-310中任一者的最后83個(gè)核 巧酸給出。運(yùn)種序列的其他優(yōu)選范例由SEQ ID NO. 140和任一SEQ ID NO.46至83組合的最 后（即從3'末端起計(jì)數(shù))83個(gè)核巧酸給出，其中SEQ ID NO. 140的序列與任一SEQ ID NO.46 至83的5/末端緊鄰融合。
[0056] 對(duì)于每個(gè)群組，SEQ ID N0.161-170、221-230、276-285和301-310的序列按遞降優(yōu) 選順序排序。例如，SEQ ID NO.161比沈Q ID NO.162更優(yōu)選，并且沈Q ID NO.221比沈Q ID NO. 230更優(yōu)選。然而，運(yùn)些群組按遞增優(yōu)選順序如此排序，從而SEQ ID NO. 221比SEQ ID NO. 161 或沈Q ID NO. 170更優(yōu)選。
[0057] 在本申請(qǐng)中公開的序列當(dāng)中，SEQ ID N0.161-170、221-230、276-285和301-310的 序列是特殊的，因?yàn)檫\(yùn)些序列經(jīng)檢驗(yàn)不影響根據(jù)SEQ ID NO.1的序列的主要已知或預(yù)測(cè)的 順式調(diào)節(jié)元件。檢驗(yàn)過的順式調(diào)節(jié)元件包含下文更詳細(xì)提到的那些，即TATA框、CPRF因子結(jié) 合位點(diǎn)、TCP I類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、bZIP蛋白G框結(jié)合因子1結(jié)合位點(diǎn)、Ry基序、谷醇溶蛋白 框、如賦予光誘導(dǎo)性的GAPDH啟動(dòng)子中的順式元件、SBF-1結(jié)合位點(diǎn)和向日葵同源域亮氨酸 拉鏈蛋白化化-4結(jié)合位點(diǎn)。已經(jīng)展示運(yùn)種方法在GUS報(bào)道基因測(cè)定法中提供種子特異性P-PvARC5、p-VfSBP和p-Bn化pin啟動(dòng)子的功能性變體并且運(yùn)種方法在通過引用方式并入本文 的W0 2012077020中更詳細(xì)地描述。
[0058] 因此根據(jù)本發(fā)明，如果增強(qiáng)子包含根據(jù)W下的任一序列
[0059] a)沈Q ID NO.20至沈Q ID NO.45的任一者，或根據(jù)W下的任一序列
[0060] b)SEQ ID N0.46-83、161-170、221-230、276-285或301-310中任一者的最后 18、 21、22、24、36或57個(gè)核巧酸，或
[0061] C)沈Q ID N0.90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103或 137的任一 者，或
[0062] d)其中插入1個(gè)額外堿基的根據(jù)b)或C)的序列，
[0063] 則它是優(yōu)選的。
[0064] 應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選地，無(wú)論A、C、G和T核巧酸的數(shù)目是多少，如果某增強(qiáng)子由SEQ ID NO. 137組成或包含SEQ ID NO. 137,則該增強(qiáng)子視為本發(fā)明的增強(qiáng)子。
[0065] 看待本發(fā)明的另一種方式是如下理解本發(fā)明：根據(jù)本發(fā)明提供了一種重組核酸， 所述核酸包含植物啟動(dòng)子和郵鄰于該啟動(dòng)子的非翻譯區(qū)，其中非翻譯區(qū)包含本發(fā)明的增強(qiáng) 子。如上文描述，增強(qiáng)子由至少18個(gè)連續(xù)核巧酸組成或包含至少18個(gè)連續(xù)核巧酸，其中至少 14個(gè)核巧酸是腺巧或胞巧。優(yōu)選的增強(qiáng)子和非翻譯區(qū)域尤其在上文更詳細(xì)地描述。如上文 所述，增強(qiáng)子優(yōu)選地相對(duì)于啟動(dòng)子是異源的。
[0066] 根據(jù)本發(fā)明，只要未翻譯的區(qū)域存在于啟動(dòng)子的最3'端TATA框和非翻譯區(qū)或增強(qiáng) 子的5/末端之間，則非翻譯區(qū)或增強(qiáng)子與啟動(dòng)子郵鄰。優(yōu)選地，增強(qiáng)