一種含酸性蛋白酶的酒精復(fù)合酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及復(fù)合酶，具體涉及一種含酸性蛋白酶的酒精復(fù)合酶及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生產(chǎn)酒精的原料主要是玉米、小麥等糧食作物和紅薯（干）、木薯（干）、甘蔗糖 蜜（桔水）等非糧食作物。在這些植物的果實(shí)或根莖里，除了一定量的淀粉多糖外，還有部 分非淀粉多糖、果膠、蛋白質(zhì)、灰份、維生素和生物素等。酒精工廠在對(duì)原料進(jìn)行液化、糖化 時(shí)使用的高溫α -淀粉酶和糖化酶，可以對(duì)淀粉多糖進(jìn)行高效率的轉(zhuǎn)化，但對(duì)于非淀粉多 糖、果膠、蛋白質(zhì)、灰份等物質(zhì)卻無(wú)法水解，要靠發(fā)酵時(shí)酵母自身分泌的內(nèi)源酶來(lái)進(jìn)行水解 利用。然而，由于作用環(huán)境因素和酵母本身的特點(diǎn)，這種分解是緩慢的、低效率的?，F(xiàn)代酶 工程技術(shù)的發(fā)展為充分利用上述物質(zhì)提供了可行的技術(shù)手段，酒精復(fù)合酶正是針對(duì)酒精生 產(chǎn)中存在的這些特點(diǎn)而設(shè)計(jì)的一款新型復(fù)合酶制劑。
[0003] 采用濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精，可縮短發(fā)酵周期，降低能耗，提高設(shè)備利用率，是一種具 有巨大應(yīng)用價(jià)值的酒精發(fā)酵技術(shù)，隨著酶生產(chǎn)技術(shù)的成熟，國(guó)內(nèi)外對(duì)濃醪發(fā)酵生產(chǎn)酒精的 研究從未停止。比如，大量研究表明，在玉米酒精濃醪發(fā)酵過(guò)程中分別添加適量植酸酶、酸 性蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶，可進(jìn)一步提高酒精產(chǎn)量，增加原料出酒率。因此，研究開(kāi)發(fā) 適于酒精生產(chǎn)的酒精復(fù)合酶是降低酒精生產(chǎn)成本的重要手段之一。在酒精濃醪發(fā)酵條件 下，為縮短發(fā)酵周期必須加快發(fā)酵速度，而玉米原料除含有大量淀粉外，還含有一定量的粗 纖維、粗蛋白和油脂，與淀粉顆粒緊密結(jié)合，影響淀粉水解速度。因此，添加適當(dāng)酒精復(fù)合 酶，一方面可以進(jìn)一步破壞原料結(jié)構(gòu)，充分發(fā)揮糖化酶的作用，從而增加可發(fā)酵性糖，提高 原料出酒率；另一方面可以為酵母提供充足的氮源、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)酵母生長(zhǎng)繁 殖，增加主發(fā)酵時(shí)酵母濃度，從而加快發(fā)酵速度，提高酵母酒精耐性。
[0004] 在近十年中，酒精生產(chǎn)技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步，使得該行業(yè)變得更有利可圖。但 是，利潤(rùn)率仍然很低。細(xì)菌污染是酒精得率和品質(zhì)下降的主要原因之一。為了能控制成本 效率，抑制酒精發(fā)酵中的細(xì)菌極其重要。在燃料乙醇的生產(chǎn)中，一般通過(guò)在發(fā)酵過(guò)程中添加 抗生素作為工藝助劑而達(dá)到此目的。目前，日益增長(zhǎng)的對(duì)在農(nóng)業(yè)和技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用抗生素而 使病原菌產(chǎn)生抗生素多種抗性的關(guān)注，已產(chǎn)生了采用一種安全天然替代品的強(qiáng)烈要求。發(fā) 酵共產(chǎn)物為酒精廠的經(jīng)濟(jì)效率作出了重要的貢獻(xiàn)。越來(lái)越多的酒精生產(chǎn)商因聲稱他們的發(fā) 酵共產(chǎn)物中不含有抗生素而得利。致力于促進(jìn)可再生能源的生物乙醇生產(chǎn)商尤其受使用可 能導(dǎo)致環(huán)境危害的工藝助劑的爭(zhēng)執(zhí)所困擾。某些地區(qū)已實(shí)施了嚴(yán)格的規(guī)定，如2005年底， 在歐盟內(nèi)被用于作為動(dòng)物飼料的復(fù)合物，其發(fā)酵共產(chǎn)物不允許有抗生素殘留。
[0005] 綜上，在發(fā)酵工藝和方式確定后，提高酒精產(chǎn)量和質(zhì)量的焦點(diǎn)問(wèn)題是酒精復(fù)合酶 的應(yīng)用和防止發(fā)酵過(guò)程雜菌（乳酸菌）的污染。中國(guó)專利CN 101245339 Β公開(kāi)了一種可 替代酵母的營(yíng)養(yǎng)鹽和酒精及燃料乙醇專用糖化營(yíng)養(yǎng)復(fù)合酶，培養(yǎng)的酵母健壯，酵母細(xì)胞數(shù) 多，酶活性強(qiáng)，同時(shí)酵母對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期長(zhǎng)，抑制雜菌生長(zhǎng)，降低酸度；縮短發(fā)酵時(shí)間；還增加可 發(fā)酵糖，可以提高原料的利用率，提高酒精度，給企業(yè)帶來(lái)可觀的經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明涉及酒 精酵母營(yíng)養(yǎng)復(fù)合酶，它的成分組成按重量份數(shù)比為：蛋白酶2 - 3份；植酸酶1 一 2份；淀 粉酶1 一 2份；纖維素酶2 - 3份；支鏈淀粉酶1 一 2份。本發(fā)明在使用時(shí)，只須在酒精 生產(chǎn)中按原料的0.5%。（W/W)撒入酒母培養(yǎng)罐的醪液中即可，操作工序簡(jiǎn)單。中國(guó)專利CN 103571878 A公開(kāi)了一種用于菊芋粉發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇的復(fù)合劑，它包含有：耐高溫ct 一 淀粉酶8 - 10份；復(fù)合酶：糖化酶80 - 100份、普魯蘭酶30 - 40份、纖維素酶酶15 - 20 份、酸性蛋白酶8 - 15份、果膠酶15 - 25份、菊粉酶20 - 30份、β -葡聚糖酶5 - 10份、 β -甘露聚糖酶3 - 6份、木聚糖酶5 - 15份、植酸酶3 - 5份；耐高溫釀酒干酵母80 - 90份。本發(fā)明的有益效果是：采用本復(fù)合劑進(jìn)行發(fā)酵菊粉生產(chǎn)燃料酒精，操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性 好、發(fā)酵周期短、轉(zhuǎn)化效率高、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)利用菊芋發(fā)酵，大規(guī)?；?產(chǎn)燃料乙醇具有一定的指導(dǎo)意義。上述公開(kāi)專利的缺陷是：1)用于酒精生產(chǎn)的復(fù)合酶只是 簡(jiǎn)單的商品酶制劑的組合，酶系不全；2)沒(méi)有解決復(fù)合酶制劑的酶活力及其存儲(chǔ)穩(wěn)定性的 問(wèn)題，復(fù)合酶應(yīng)用受限；3)沒(méi)有從根本上解決防止雜菌污染導(dǎo)致酒精產(chǎn)量和質(zhì)量下降的問(wèn) 題。
[0006] 因此，制備一種酶系全、酶活力高、存儲(chǔ)穩(wěn)定、有效防止發(fā)酵全程雜菌污染的可顯 著提高酒精產(chǎn)量和質(zhì)量的酒精復(fù)合酶迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有酒精復(fù)合酶中蛋白酶活力低、復(fù)合酶酶系 不全、抗氧化能力低、酶活損失大、無(wú)抑菌作用或抑菌作用弱的缺陷，以高活力酸性蛋白酶 等食品級(jí)酶制劑為主要原料，科學(xué)復(fù)配植物提取物、抗氧化劑、啤酒花提取物、脫霉素、保護(hù) 劑、激活劑、耐酒精活性干酵母等，制備一種酶系全面、酶活力穩(wěn)定、酶效力高的含酸性蛋白 酶的酒精復(fù)合酶，該復(fù)合酶可有效提高酒精產(chǎn)率和質(zhì)量，適合各種原料制備酒精或燃料乙 醇。
[0008] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0009] -種含酸性蛋白酶的酒精復(fù)合酶，由以下重量份數(shù)的原料組成：
[0010] 淀粉酶20 - 30份，蛋白酶15 - 25份，植物提取物10 - 15份，半纖維素酶10 - 12 份，啤酒花提取物10 - 12份，果膠酶8 - 10份，酯酶8 - 10份，耐高溫釀酒干酵母7 - 10 份，脫霉素5 - 10份，植酸酶5 - 7份，保護(hù)劑4 一 6份，激活劑4 一 6份，抗氧化劑0. 6 - 1· 2 份；
[0011] 所述淀粉酶是由以下質(zhì)量百分比組成的酶制劑均勻混合而成：70%糖化酶，10% 普魯蘭酶，10%真菌Ct 一淀粉酶，5% β -淀粉酶，5%中溫a -淀粉酶；
[0012] 所述植物提取物中含有蛋白酶、淀粉酶、半纖維素酶、酯酶、氧化還原酶等多種植 物酶；
[0013] 所述植物提取物中還含有植物多糖和單糖、植物淀粉、植物蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不僅 可為白酒釀造復(fù)合酶提供全面、豐富的植物酶，還可作為制備酸性蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基成 分，提高蛋白酶活力和微生物產(chǎn)酶能力；
[0014] 所述植物提取物采用超聲清洗、微波輔助超聲提取和高壓脈沖電場(chǎng)提取、超濾濃 縮等低溫提取技術(shù)，有效提高了原料利用率、植物酶活性和產(chǎn)率；有效保證了植物提取物的 食品安全性；
[0015] 所述植物提取物的制備方法為：將大麥芽和小麥芽按質(zhì)量比5 - 7 :3 - 5均勻混 合，粉碎至粒度0. 5 - 1mm，得粉碎麥芽；然后將木瓜、菠蘿、無(wú)花果分別于超聲波清洗機(jī)中 在功率200W、頻率30KHz條件下超聲清洗5 - lOmin，浙干，室溫下破碎至粒度0. 5 - 1mm，并 按質(zhì)量比5 - 7 :2 - 4 :1 一 3均勻混合，加入混合物質(zhì)量1. 5 - 3倍的粉碎麥芽得原料混合 物，加入原料混合物質(zhì)量1 一 3倍的水，用檸檬酸調(diào)節(jié)pH值為3 - 4,在功率150 - 300W、頻 率2000Hz條件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波輻照總時(shí)間60 - 80s，進(jìn)行間隔式輻照：輻 照l(shuí)〇s，間隔10s，控制溫度20 - 35°C，如此輻照10次，同時(shí)在功率200 - 300W，頻率30 - 40KHz條件下進(jìn)行超聲波輔助提?。槐? 一 3h，然后，在功率200 - 400W、頻率2000Hz條 件下進(jìn)行微波提取，其中，每次微波輻照總時(shí)間90 - 105s，進(jìn)行間隔式輻照：輻照15s，間隔 l〇s，控制溫度40 - 60°C，如此輻照10次，同時(shí)在功率300 - 500W，頻率40 - 50KHz條件 下進(jìn)行超聲波輔助提取，最后自然降溫至室溫，于電場(chǎng)強(qiáng)度25 - 35kV/cm，脈沖時(shí)間400 - 600 μ s，脈沖頻率200 - 300Hz條件下進(jìn)行高壓脈沖電場(chǎng)（PEF)提取15 - 20min ;提取液 過(guò)濾得第一濾液，加濾渣2倍的水漂洗、過(guò)濾得第二濾液，將第一濾液和第二濾液按質(zhì)量比 1 :1 一 2均勻混合，混合液超濾濃縮、冷凍干燥、低溫粉碎即得植物提取物；
[0016] 優(yōu)選地，所述超聲波清洗機(jī)中清洗液為0. 3 - 0. 5%的碳酸氫鈉溶液。
[0017] 所述蛋白酶是由以下質(zhì)量百分比組成的酶制劑均勻混合而成：酸性蛋白酶80%， 中性蛋白酶10%，10%脯氨酸蛋白酶；
[0018] 優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶是以高產(chǎn)酸性蛋白酶的菌株宇佐美曲霉（Aspergillus usamil)CCTCC NO :M 2013601為出發(fā)菌株，經(jīng)特定發(fā)酵條件下的液體深層發(fā)酵而制得，并且 發(fā)酵培養(yǎng)基中科學(xué)復(fù)配了上述制備的植物提取物；
[0019] 優(yōu)選地，所述酸性蛋白酶的制備方法包括以下步驟：保存完好的宇佐美曲霉CCTCC NO :M 2013601的菌種經(jīng)斜面菌種活化、一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)液體種子擴(kuò)大培養(yǎng)至種子罐，將種 子罐液體種子以5%接種量接入發(fā)酵罐培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度31 - 321：，攪拌速度200-40(^/ m，通風(fēng)量1:1-2,培養(yǎng)時(shí)間10-12h ;然后以1 一 2°C /h降溫速率緩慢降溫至26 - 30°C，攪 拌速度400-600r/m，通風(fēng)量1:1-3,恒溫培養(yǎng)8-10h ;繼續(xù)以1 一 2°C /h降溫速率緩慢降溫 至23 - 251：，攪拌速度500-70(^/111，通風(fēng)量1:2-4，培養(yǎng)時(shí)間22-3111，然后，將種子罐液體 種子以3%接種量追加接入發(fā)酵罐，最后以1 一 2°C /h升溫速率緩慢升溫至31 - 32°C，攪 拌速度200-400r/m，通風(fēng)量1:1-2,恒溫培養(yǎng)10-12h ;接著以1 一 2°C /h降溫速率緩慢降溫 至23 - 25°C，攪拌速度500-700r/m，通風(fēng)量1:2-4,恒溫培養(yǎng)22-31h ;發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾、濃縮、 調(diào)配、精濾、干燥得固體酸性蛋白酶；
[0020] 所述斜面培養(yǎng)基組成為：葡萄糖20g，瓊脂20g，中草藥提取物5 - 10g，干酪素4g， 磷酸氫二鉀2g，氯化鎂0. 6g，氯化鉀0. 8g，蒸餾水1000mL，pH值5. 8,121°C滅菌20min。
[0021] 所述一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子培養(yǎng)基組成為：麩皮60 - 80g，玉米粉50_60g，豆餅粉 35-40g，海藻糖10 - 15g，魚(yú)粉6-10g，氯化銨10 -