一種具有水產(chǎn)病原菌拮抗特性的凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種具有水產(chǎn)病原菌拮抗特性的凝結(jié)芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù) 領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展，極大地豐富了人們的物質(zhì)生活。但隨著高密度 集約化養(yǎng)殖規(guī)模日益擴(kuò)大，養(yǎng)殖水體生態(tài)環(huán)境日益惡化，極大地增加了水產(chǎn)動(dòng)物之間病原 體交叉感染的機(jī)會(huì)，造成各類魚病多發(fā)，甚至水產(chǎn)動(dòng)物大面積的死亡。針對(duì)魚病的防治，傳 統(tǒng)的方法是使用抗生素，短期可能起到較好的效果，但長(zhǎng)期使用容易導(dǎo)致病原菌的耐藥性 越來越強(qiáng)，水生動(dòng)物腸道內(nèi)菌群失衡，長(zhǎng)期富集在體內(nèi)通過食物鏈影響人類健康等弊端。用 微生態(tài)制劑進(jìn)行水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害的防治是近年發(fā)展起來的一種新方法，能夠有效避免服 用抗生素所造成的耐藥性和二次感染等，其憑借獨(dú)特的調(diào)節(jié)腸道菌群的功能而備受世人矚 目。
[0003] 乳酸菌類益生菌是目前我國農(nóng)業(yè)部、美國食品及藥物管理局（FDA)等國內(nèi)外政府 批準(zhǔn)使用的數(shù)量最多、效果較好的一類安全微生物菌種。它具有以下特點(diǎn)：耐酸，在pH為 3. 0 - 4. 5時(shí)仍可生長(zhǎng)，適應(yīng)于胃腸的酸性環(huán)境；乳酸菌是動(dòng)物腸道的正常菌群，在腸系統(tǒng) 定植，在體內(nèi)通過生物拮抗，拮抗革蘭氏陰性致病菌，維持腸道中正常的生態(tài)平衡；可降低 腸道pH值，阻止和抑制有害物質(zhì)，增強(qiáng)抗感染能力；活菌體內(nèi)的代謝產(chǎn)物中含有較高的超 氧化物歧化酶（S0D)，能增加動(dòng)物的體液免疫和細(xì)胞免疫，增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)活性，促進(jìn) 生長(zhǎng)。但普通乳酸菌在生長(zhǎng)過程中，不形成芽孢，抗逆性差，易失活，難保藏，所以在飼料工 業(yè)中的應(yīng)用受到一定限制。本發(fā)明所應(yīng)用的凝結(jié)芽孢桿菌正好彌補(bǔ)這一缺憾。凝結(jié)芽孢桿 菌，是一類能夠產(chǎn)芽孢的乳酸菌，除了具有乳酸菌的特點(diǎn)外，還具有 抗逆性強(qiáng)、耐高溫、易保存、存活率高等優(yōu)點(diǎn)。
[0004] 本發(fā)明涉及凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1對(duì)多種水產(chǎn)常見病菌的廣譜拮抗作用， 同時(shí)該菌株還兼具養(yǎng)殖環(huán)境控制功能和促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)的特點(diǎn)，是一種新型的多功能 微生物。目前尚無凝結(jié)芽孢桿菌此方面的專利報(bào)道。
[0005] 在水廣養(yǎng)殖中應(yīng)用該囷株制備的微生態(tài)制劑能夠1?效調(diào)控水質(zhì)、防治疾病、促進(jìn) 水生動(dòng)物生長(zhǎng)，滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)疾病防控、水體生態(tài)環(huán)境治理和健康養(yǎng)殖的高度需求。在淡 水生態(tài)健康養(yǎng)殖推廣應(yīng)用中，與傳統(tǒng)的以藥物使用為主的水質(zhì)調(diào)控和病害防治技術(shù)相比， 微生態(tài)制劑具有主動(dòng)預(yù)防，無毒、無殘留，無污染的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)形成良好的養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，減少 養(yǎng)殖污水的排放，消除水產(chǎn)品中藥物的殘留，保護(hù)環(huán)境具有重要意義。同時(shí)作為水產(chǎn)飼料添 加劑能夠有效促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物健康生長(zhǎng)，帶動(dòng)水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的提高，促進(jìn)水產(chǎn)養(yǎng)殖 戶增產(chǎn)增收。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖常見病原菌具有拮抗作用、能夠凈化養(yǎng)殖水 體、促進(jìn)水生動(dòng)物生長(zhǎng)的凝結(jié)芽孢桿菌菌株。
[0007] 為達(dá)到以上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：提供一株具有水產(chǎn)病原菌拮抗特性的 凝結(jié)芽孢桿菌菌株，分離自魚類腸道，該菌株的分類命名為：凝結(jié)芽孢桿菌 JSSW-LA-07-1，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏號(hào)：CGMCC No. 10182。本發(fā)明的凝結(jié)芽孢桿菌菌株JSSW-LA-07-1，革蘭氏陽性菌，鏡檢 呈桿狀，細(xì)胞直徑< 1 μ m，芽孢膨大。在MRS平板上菌落直徑為2. 0-3. Omm，形態(tài)不規(guī)則，表 面褶皺、不透明、無色素。在LB培養(yǎng)基上可得大量圓形、表面褶皺、不透明、白色的菌落。
[0008] 本發(fā)明的制備工序如下： (1)菌種活化： 無菌開啟凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1的凍干保藏菌種，劃線接種于麩皮營養(yǎng)瓊脂試 管斜面，于30-37 °C培養(yǎng)24-48 h，然后劃線轉(zhuǎn)接于麩皮營養(yǎng)瓊脂茄子瓶斜面，30-37 °C培 養(yǎng)24-48 h。鏡檢，當(dāng)90 %以上菌體形成芽孢時(shí)，即為成熟。反復(fù)活化2-3次，種子菌懸液以 體積比1%-1〇%接種量接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，三角瓶裝液量為體積比10%-20%， 轉(zhuǎn)速為100-180 rpm，30-37°C恒溫振蕩培養(yǎng)20-24h ; 斜面培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：蛋白胨10,牛肉膏3, NaCl 5,瓊脂15-20,蒸餾水1L，pH 7. 0-7. 2。
[0009] 發(fā)酵培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)：麩皮5-20,酵母膏5-10,豆柏粉5-10, Κ2ΗΡ04 3, NaCl 5, MnS04 · H20 0· 3，蒸餾水 1L，pH 7· 0。
[0010] (2)抑菌性測(cè)定： 將無菌濾紙片在濃度約為?ο7 CFU/mL凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1新鮮培養(yǎng)液中浸泡 1.0 h。取濃度約5X106 CFU/mL的水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見致病菌嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維 氏氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌、愛德華氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、溶藻弧 菌的液體培養(yǎng)液〇. 1 mL，分別涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基平皿上，然后將浸泡過菌液的濾紙片貼 于培養(yǎng)皿上，每個(gè)平皿貼3片，每個(gè)平皿做3個(gè)重復(fù)。平皿置于25-30°C培養(yǎng)箱中24、48 h， 測(cè)量抑菌圈大小。
[0011] (3)凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1菌粉制劑的制備及應(yīng)用： 菌種JSSW-LA-07-1活化后經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵液高速離心收集濕菌體，濕菌體與 干淀粉以質(zhì)量比1:2-10進(jìn)行混合，在30-50°C下干燥20-24h，粉碎機(jī)粉碎，過0. 9mm篩，獲 得的凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1菌粉制劑，濃度不低于5. OX 10s個(gè)（CFU) /克。
[0012] 用所述方法制備的凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1菌粉制劑的應(yīng)用，用作漁業(yè)養(yǎng)殖 飼料的添加劑，在飼喂基礎(chǔ)日糧中添加1. 0-5. Omg *kg 1的凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1 菌粉制劑；用作水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)改良劑，按50-200g/畝?米的用量全池潑灑凝結(jié)芽孢桿菌 JSSW-LA-07-1 菌粉制劑。
[0013] 本發(fā)明的有益效果： 凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1能夠有效抑制嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單 胞菌、豚鼠氣單胞菌、鰻利斯頓氏菌、愛德華氏菌、副溶血性弧菌的生長(zhǎng)，其中對(duì)溫和氣單胞 菌、豚鼠氣單胞菌的抑制效果優(yōu)于其他種類致病菌。因此，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用凝結(jié)芽孢桿菌 JSSW-LA-07-1菌粉制劑能夠有效防控由病原菌引發(fā)的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害，保護(hù)水生動(dòng)物健 康生長(zhǎng)。
[0014] 凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1菌粉制劑作為漁業(yè)養(yǎng)殖飼料添加劑能夠顯著提高水 生動(dòng)物的增重率、特定增長(zhǎng)率，顯著降低餌料系數(shù)。
[0015] 凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1菌粉制劑作為水產(chǎn)養(yǎng)殖用水質(zhì)改良劑能夠有效降低 水體中的污染物含量，改善養(yǎng)殖水質(zhì)。
[0016] 生物材料樣品保藏：凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07-1,已保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽區(qū)北辰 西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2014年12月15日，保藏號(hào)為：CGMCC No.10182。
【附圖說明】
[0017] 圖1 JSSW-LA-07-1的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1 :菌種的篩選和分離 在無錫鵝湖養(yǎng)殖池塘采集異育銀鯽樣品，將魚體解剖取腸道，加入生理鹽水，研磨制成 勻漿液，每個(gè)樣品吸取1.0 mL，80°C加熱10 min，取移液槍吸取0. 1 mL于YPD固體培養(yǎng)基 上，涂布，37°C培養(yǎng)。根據(jù)菌落大小選取生長(zhǎng)良好的菌落反復(fù)接種篩選，直至得到均勻的單 個(gè)菌落，命名為JSSW-LA-07-1。
[0019] 實(shí)施例2:菌種鑒定 (1)形態(tài)特征 菌株JSSW-LA-07-1，革蘭氏染色為陽性，鏡檢呈桿狀，細(xì)胞直徑< ΙμL?，能形成芽孢。 在MRS平板上菌落直徑為2. 0-3. 0mm，形態(tài)不規(guī)則，表面褶皺、不透明、無色素。在LB培養(yǎng)基 上可得大量圓形、表面褶皺、不透明、白色的菌落。
[0020] (2)生化特性 菌株JSSW-LA-07-1，革蘭氏染色為陽性，接觸酶、β -半乳糖苷酶、VP試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn) 為陽性，能在50°C環(huán)境下生長(zhǎng)。氧化酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧 酶試驗(yàn)為陰性，不能水解淀粉、明膠、酪素，不產(chǎn)生吲哚和H 2S，不能在檸檬酸上生長(zhǎng)。
[0021] 生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該菌株能利用D-纖維二塘、a -D-葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、 D-海藻糖、糊精、D-蜜二糖、Ν-乙酰-D-葡萄胺、甘油，產(chǎn)L-乳酸、丙酮酸甲酯。反硝化試 驗(yàn)為陽性，說明該菌株能夠降解水體中的含氮化合物。
[0022] 化學(xué)敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株對(duì)林可霉素、二甲胺四環(huán)素、夫西地酸、鹽酸胍、 氯化鋰、十四烷硫酸鈉、D-絲氨酸、萬古霉素、醋竹桃霉素、利福霉素 SV、丁酸鈉、溴酸鈉、