一種dna類樣本保存稀釋液及其制備
【專利說明】一種DNA類樣本保存稀釋液及其制備
[0001 ]所屬領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物制品技術(shù)領(lǐng)域，屬于聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR)技術(shù)領(lǐng)域核糖核酸 (DNA)類樣本的稀釋和保存范疇，涉及DNA類樣本稀釋液的制備方法及其應(yīng)用。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)技術(shù)是重要的分子生物學(xué)技術(shù)，對現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展 起到非常重要的作用。PCR技術(shù)特點是高靈敏度、高特異性、省時快速，直接檢測目的基因的 樣本分為DNA類樣本或RNA類樣本，但是對樣本的稀釋和保存要求甚高。核糖核酸(縮寫為 RNA，即RibonucleicAcid)，存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA 由核糖核苷酸經(jīng)磷酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和堿基構(gòu) 成。RNA的堿基主要有4種，即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶，其中，U(尿嘧啶）取代了 DNA中的T ANA的質(zhì)量好壞和濃度高低直接影響著檢測結(jié)果，DNA酶是DNA降解的主要原因， DNA酶是一類生物活性非常穩(wěn)定的酶，除細胞內(nèi)DNA酶外，環(huán)境中的灰塵、各種實驗器皿和試 劑、人類皮膚的汗液、唾液中均存在DNA酶，且DNA酶耐熱、耐酸堿，蛋白變性劑可使之暫時失 活，但變性劑去除后，又可恢復(fù)活性。所以在DNA提取過程中必須避免外源性DNA酶的污染和 抑制內(nèi)源性DNA酶的活性。DNA易受外界物理因素:溫度、濕度;化學(xué)因素:pH值、水解反應(yīng)、氧 化反應(yīng);生物因素:酶解及微生物侵染等作用等因素而降解
[0005] 在現(xiàn)有的DNA類樣本稀釋保存方法中，主要方法有：1)稀釋液用DEPC水、DNAsin等； 2)保存主要用液氮或低溫保存。其缺點是：1)不同類型的DNA類樣本(血清、血漿、組織、尿 液、分泌物、培養(yǎng)液等)無法用同一種緩沖液或稀釋液;2)各種緩沖液或稀釋液保存的效果 質(zhì)量差，DNA容易降解;3)保存后的樣本要快速進入液氮或低溫保存，室溫保存時間過短。因 此，開發(fā)一種高效防止DNA降解且能適用不同DNA類樣本的稀釋保存液，具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種DNA類樣本稀釋保存液的制備方法。可作為臨床不同類 型的DNA類樣本(血清、血漿、組織、尿液、分泌物、培養(yǎng)液等)的樣本稀釋或/和保存。
[0007] 本發(fā)明的DNA類樣本稀釋保存液制備方法如下：
[0008] 1、量取若干毫升去離子純化水；
[0009] 2、分別加入二甲基亞砜（1 % ~3% [v/v])、山梨醇（0· 5mol/L~lmol/L)、Tris-HCl (0 · 01mol/L~0 · 05mol/L)，乙二胺四乙酸（0 · 01mol/L~0 · 05mol/L)，Triton_100(0 · 1 % ~ 0.5%卜八])，即-40(0.1%~0.5%卜八])、〇1616叉-100(1%~5%[￥八])、疊氮鈉(0.08% ~0 · 1 % [w/v])，鏈霉素(400U/ml ~800U/ml);
[0010] 3、調(diào)pH值至7.8~8.2后定容；
[0011] 4、密封后高壓滅菌，室溫備用。
[0012] 本發(fā)明為一種可直接使用的樣品保存液，其原理是抑制DNase活性，可有效保護新 鮮樣本里的DNA免受降解。具有穩(wěn)定、易保存、便捷等優(yōu)點。適用于血清、血漿、組織、尿液、分 泌物等DNA類樣本的保存和稀釋。浸入DNA類樣本稀釋保存液后，新鮮組織細胞中DNA可以完 好的在37°C下保存1周，在25°C下保存1個月，4°C下保存6個月，在-20°C或_80°C下長期保 存。
【附圖說明】
[0013] 圖1顯示對照組PCR擴增檢測圖
[0014] 圖2顯示實驗組PCR擴增檢測圖
[0015] 圖3顯示37°C環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖
[0016] 圖4顯示37°C環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖
[0017] 圖5顯示37°C環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖
[0018] 圖6顯示37°C環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖
[0019] 圖7顯示室溫環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖
[0020] 圖8顯示室溫環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖
[0021] 圖9顯示室溫環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖 [0022]圖10顯示室溫環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖 [0023]圖11顯示2-8°C環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖
[0024]圖12顯示2-8°C環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖 [0025]圖13顯示2-8°C環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖
[0026] 圖14顯示2-8°C環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖
[0027]圖15顯示_20°C環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖 [0028] 圖16顯示-20°C環(huán)境中普通稀釋液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖
[0029] 圖17顯示-20°C環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(P2)PCR擴增檢測圖
[0030] 圖18顯示-20°c環(huán)境中RNA類樣本稀釋保存液稀釋的樣本(Pl)PCR擴增檢測圖
【具體實施方式】
[0031]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用于限制本發(fā)明。實施例中所用的技術(shù)手段若 為特殊指明，均為常規(guī)方法。實施例中涉及到的試劑與耗材若無特殊說明均可從商業(yè)途徑 獲取。以下實施例中的DNA類樣本稀釋保存液測試實驗。
[0032] 實施例1 :RNA稀釋保存液的制備（100ml)
[0033] 1)量取30ml去離子純化水，加入滅菌燒杯中；
[0034] 2)吸取lml的二甲基亞砜加入燒杯中，并攪拌均勻；
[0035] 3)稱取18.2g的山梨醇加入燒杯中，并攪拌溶解；
[0036] 4)稱取0· 12g的Tris-HCl加入燒杯中，并攪拌溶解；
[0037] 5)吸取10mlENDA(0.5mol/L)加入燒杯中，并攪拌均勻；
[0038] 6)吸取0.5mlTriton-100加入燒杯中，并攪拌均勻；
[0039] 7)吸取10mlNP-40(l%)加入燒杯中，并攪拌均勻；
[0040] 8)稱取lg的Chelex-100加入燒杯中，并攪拌均勾；
[0041 ] 9)稱取0. lg的疊氮鈉加入燒杯中，并攪拌溶解；
[0042] 10)吸取0.4ml的鏈霉素(200U/u 1)加入燒杯中，并攪拌均勻；
[0043] 11)用氫氧化鈉調(diào)pH值至7.8~8.2;
[0044] 12)把已經(jīng)調(diào)好pH的溶液轉(zhuǎn)移到100ml的容量瓶中，用去離子純化水定容到10